鑒定具有無限增殖或腫瘤形成潛力之人和動物細(xì)胞的方法技術(shù)

適用于檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的ＤＮＡ－蛋白質(zhì)－復(fù)合物，通過分離密度為約１．８２－１．８９ｇ／ｃｍ↑［３］的轉(zhuǎn)化的人或動物細(xì)胞胞質(zhì)的無線粒體組分和從該組分中通過用酚提取和乙醇沉淀分離復(fù)合物而得到所述的ＤＮＡ－蛋白質(zhì)－復(fù)合物。（*該技術(shù)在2014年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及適用于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力之細(xì)胞的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)DNA序列和抗體；得到所述DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)或DNA序列的方法以及它們鑒定具有無限增殖和腫瘤形成潛力之人和動物細(xì)胞的用途。所有分化的人和動物細(xì)胞在其衰老和死亡之前均具有有限的體內(nèi)和體外增殖潛力。在一給定的時間，可能有的細(xì)胞分裂數(shù)目取決于細(xì)胞的分化程度，其年齡和細(xì)胞所來自的供體的種類，以及細(xì)胞培養(yǎng)的持續(xù)時間(Goldsten，S.Replicative Senescence，Science 249(1990)，1129-1133)。然而經(jīng)常在腫瘤形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中見到無限增殖。因此，它們形成導(dǎo)致腫瘤形成的不斷生長的合胞體，最后隨著這些細(xì)胞的其它特性的改變，導(dǎo)致腫瘤疾病。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤的臨床特征在于它們生長迅速并經(jīng)常轉(zhuǎn)移。細(xì)胞的腫瘤形成轉(zhuǎn)化的特征在于也取決于細(xì)胞分化程度的大量細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)之改變的異型圖像。到目前為止，僅僅了解很少的腫瘤轉(zhuǎn)化的分子水平上可確定的參數(shù)；例如它們包括某些基因甲基化的改變程度(W.Doerfler et al.，Eukaryotic DNA甲基化事實和問題，F(xiàn)EBS Letters 268(1990)，329-330)，修飾基因的表達，或某些基因產(chǎn)物的改變的磷酸化。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共性是具有無限的體內(nèi)增殖能力。基于各種觀察，研究人員認(rèn)為不依賴于生長因子的腫瘤細(xì)胞的增殖確實是腫瘤形成細(xì)胞經(jīng)常有的特征，但并不是絕對必需的(M.Strauss，B.E.Griffin，Cellular Immortalization，Cancer Cells 2(1990)，360-365)。然而，對于診斷和治療領(lǐng)域的許多問題來說，鑒別那些不再遵循正常的增殖控制并因此獲得無限增殖潛力的那些細(xì)胞是很重要的。在此所涉及的問題是將腫瘤細(xì)胞無限增殖的這種特性與在許多組織中所見到的再生能力區(qū)別開。再生是一種受控的短期(短暫)細(xì)胞復(fù)制，并且作為對生理刺激的反應(yīng)，僅僅是程序化細(xì)胞死亡的間歇抑制。在組織再生后，正常細(xì)胞的短期增殖又會由未鑒定的信號抑制。檢測惡性腫瘤細(xì)胞的已知方法是以臨床，組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究為基礎(chǔ)，并以改變的生理學(xué)檢測結(jié)果為依據(jù)。以組織學(xué)檢測為基礎(chǔ)，常規(guī)診斷方法通常是進行組織切片(W.A.D.Anderson and J.M.Kissane，Pathology I，II，Mosby，Saint Louis 1977，7th edition；C.S.Herrington andJ.O.D.McGee，Diagnostic Molecular Pathology，Oxford University Press，Vol.I，II.1st ed.，1992)。與良性生長相反，惡性細(xì)胞群與相鄰組織僅有模糊的分界，并且細(xì)胞生長到其周圍組織中浸潤并破壞之。大多數(shù)情況由病灶周圍的炎癥引發(fā)。通常許多有絲分裂會提高腫瘤細(xì)胞的增生活性。除這些組織學(xué)檢測外，利用抗體檢測增生的惡性細(xì)胞的方法變得越來越普遍使用，所述的抗體能識別最好是由增生的腫瘤細(xì)胞表達的抗原例如Ki67(D.C.Matthews，F(xiàn).O.Smith，I.D.Bemstein，Monoclonalantibodies in the study and therapy of hematopoietic cancers，Curr.OpinionImmunol.4(1992)，641-646；M.Schwouzen，V.Diehl，M.Pfreundschuh，immunozytologische Phanotypisierung von Leukamien und Lymphomen，Med.Klinik 85(1990)，533-547)。但是，這些方法是以確定間接參數(shù)為基礎(chǔ)，而沒有檢測與無限增生有關(guān)的分子過程。因此，本專利技術(shù)的目的之一是在給實驗室動物注射后，以無需體外培養(yǎng)這些細(xì)胞或使其繁殖的快速可行的方法鑒別具有無限增殖潛力的細(xì)胞特別是惡性腫瘤細(xì)胞。它應(yīng)可以區(qū)別具有無限增殖潛力的細(xì)胞和在再生組織中短期增殖的細(xì)胞。本專利技術(shù)的上述目的用DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(下文稱為復(fù)合物)來完成，所述的復(fù)合物適用于檢測有無限增殖和腫瘤形成潛力的人和動物。得到所述的復(fù)合物可以通過從可永久分裂且在氯化銫梯度中的密度為約1.82-1.89g/cm3的人或動物細(xì)胞分離細(xì)胞質(zhì)的無線粒體組分；然后用酚提取和乙醇沉淀從該組分中分裂所述的復(fù)合物。實驗令人吃驚地表明，與正常休眠細(xì)胞，衰老細(xì)胞或短期繁殖的細(xì)胞相反，具有無限增殖和腫瘤形成潛力的細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中確實有所述的復(fù)合物。用本專利技術(shù)的這些復(fù)合物有可能檢測所述的細(xì)胞，作為惡性生長的結(jié)果，這些細(xì)胞表現(xiàn)出無限生長潛力。為了達到這一目的，通過確定DNA含量或與特異性抗體的反應(yīng)，在凝膠電泳中，人們用本專利技術(shù)復(fù)合物中的細(xì)胞質(zhì)或適宜的細(xì)胞質(zhì)組分作為標(biāo)準(zhǔn)。為了分離本專利技術(shù)的復(fù)合物，根據(jù)已知方法(例如，EP-B-0093436，EP-B-0256512和Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)，468-472 and lysed forexample using detergents like NP40 or SDS，Wigler and Weistern，Biochem.Biphys.Res.Comm.63(1975)669-674)獲取能永久分裂的人或動物細(xì)胞的胞質(zhì)體。優(yōu)選的用蔗糖梯度從這些胞質(zhì)體組分分離線粒體(J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995)。將這些不含任何線粒體的組分與RNase，優(yōu)選的是RNase A和RNase T1以及與蛋白酶，如，蛋白酶K或灰色鏈霉菌蛋白酶一起培養(yǎng)。富集該混合物中在氯化銫梯度中的密度為約1.82-1.89g/cm3的組分，然后用酚提取和乙醇沉淀從該組分中分離復(fù)合物。用氯化銫密度梯度離心和電泳分離均可以得到在氯化銫梯度中密度為約1.82-1.89g/cm3的組分；這些方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition，1989)。通過反復(fù)凍融細(xì)胞或通過得到無核DNA的細(xì)胞組分也可以得到用于分離復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)的無線粒體組分。優(yōu)選的通過用氯化鈉和SDS溶解細(xì)胞(″Hirt提取″，J.Mol.Biol.26(1967)365-369)然后離心得到所述的組分。接著從上清液中可以分離復(fù)合物。在優(yōu)選的方法中，經(jīng)用鹽梯度沉降從待測細(xì)胞的胞質(zhì)溶解產(chǎn)物中分離復(fù)合物。通過反復(fù)凍融而不用洗滌劑，將細(xì)胞溶解在含Mg2+的緩沖液(50mmol/l Tris-HCl，pH7.2，10mmol/l EDTA，3mmol/l MgCl2)中；以6000xg離心沉淀核，然后用蛋白酶K(100ug/ml)將上清液于60℃消化1小時。用CsCl兩步梯度離心(150,000xg，10小時)分離釋放的復(fù)合物；下層組分的密度為約1.80g/cm3，而上層的密度為約1.70g/cm3。胞質(zhì)復(fù)合物會沉淀，而染色體DNA或不含共價DNA結(jié)合蛋白的復(fù)合物仍會留在上清液中。利用下列特性，本方法可以迅速地分離胞質(zhì)復(fù)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：H·J·阿肯，W·艾伯特，H·容弗，
申請(專利權(quán))人：曼海姆泊靈格股份公司，
類型：發(fā)明
國別省市：