一種穩定標記肝癌細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種穩定熒光標記肝癌細胞的方法，其步驟是：肝癌細胞培養、爬片及固定；固定的肝癌細胞爬片的洗滌與封閉；肝癌細胞與作為一抗的特異性ＡＦＰ單克隆抗體的結合；ＰＢＳ洗滌爬片；用ＱＤｓ－ＩｇＧ復合物探針作為二抗進行熒光標記；ＰＢＳ洗滌爬片；４’，６－二脒基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ）復染細胞核；ＰＢＳ洗滌爬片和標本的避光保存。本發明專利技術方法易行，操作方便，可高效穩定地對肝癌細胞進行熒光標記，對肝癌細胞的長時間觀察研究提供了適宜的實驗方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬量子點免疫熒光細胞化學
，具體涉及。
技術介紹
免疫熒光細胞化學技術是采用熒光物質標記的已知抗體(或抗原)作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原(或抗體)，形成的抗原抗體復合物上帶有熒光物質，在熒光顯微鏡下，由于受到激發光源照射，熒光物質發出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質。這類技術在現代生物學和醫學中被廣泛應用，早在60多年前，由Coons等創建的免疫熒光技術，發展至今已有很大的進展。隨著高靈敏度和高特異性探針技術的不斷發展，以FITC、羅丹明為代表的傳統有機熒光染料應用存在的局限性越來越明顯激發光譜狹窄而發射譜寬，在成像中不易分辨，對于生物化學反應和代謝的抵抗力弱，抗光漂白能力低，成像發光時間短等。自1997年以來，隨著量子點(quantum dots，QDs)制備技術的不斷提高，QDs在生物醫學方面的應用也逐漸引起了廣泛的關注。QDs是一類半徑小于或接近于激子玻爾半徑的半導體納米晶粒，作為一種新型熒光材料，QDs能克服傳統有機熒光染料的不足，具有激發光譜寬且連續，檢測靈敏度高，抗光漂白能力強，熒光強度高而穩定，生物相容性好等特點。目前國外所采取的QDs標記細胞的方法主要是通過鏈(霉)親和素—生物素系統結合，這種方法操作較為復雜且成本較高，實用性不強。在癌癥研究領域，國內外尚無將QDs應用于肝癌細胞的免疫熒光標記研究的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供了，采用QDs-IgG復合物作為熒光探針，通過特異性AFP抗體間接標記肝癌細胞。方法易行，操作方便，可高效穩定地對肝癌細胞進行熒光標記，對肝癌細胞的長時間觀察研究提供了適宜的實驗方法。為了實現上述任務，本專利技術采用以下技術措施，具體步驟如下1.細胞培養人肝癌細胞株HCCLM6(Li Y，Tian B，Yang J，Zhao L，Wu X，Ye SL，Liu YK，Tang ZY.Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cellmodel system with multiple metastatic potentials established through consecutivein vivo selection and studies on metastatic characteristics.J Cancer Res ClinOncol.2004；130(8)460-468)，培養液為含10％胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的RPMI-1640培養基(Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)。培養條件37℃，5％CO2/95％空氣，飽和濕度。隔天更換培養液，每4～6天傳代一次。2.細胞培養玻片和培養皿的處理，將20mm×20mm蓋玻片和直徑9cm的玻璃培養皿用清水洗凈，2％(vol/vol)鹽酸溶液浸泡過夜，清水浸泡，用軟毛刷輕輕刷洗，烘箱烘干，溫度控制在50～70℃，放酸缸內經硫酸-重鉻酸鉀清潔液(濃硫酸100ml，重鉻酸鉀100g，蒸餾水1000ml)浸泡1～3天，自來水沖洗20次，蒸餾水洗滌10次，浸泡過夜，烘干后，干烤滅菌，溫度控制在150～170℃，2h，備用。3.細胞爬片，將蓋玻片平鋪于培養皿上，每個培養皿鋪4張蓋玻片。用0.125％胰蛋白酶(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)消化細胞，按2×106個/每個培養皿接種，37℃，5％CO2/95％空氣，飽和濕度培養3d，細胞長滿蓋玻片。4.洗滌玻片，清洗液為0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8g，Na2HPO4·7H2O 2.16g，蒸餾水1000ml)，洗滌2次，每次3min；5.固定，固定液為-20℃甲醇，每張玻片3～5ml，去除多余PBS后，固定15min。6.洗滌玻片，清洗液為0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(上述步驟4)，洗滌3次，每次3min。7.封閉，封閉液為含有1％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)和0.1％(vol/vol)曲拉通X-100(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步驟4)。封閉條件為去除多余PBS后，濕盒孵育，37℃，20～30min。8.加一抗，去除多余封閉液后，滴加鼠抗人AFP單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，濕盒孵育，37℃，1～2h(或4℃冰箱過夜)。9.洗滌玻片，清洗液為含0.5％(vol/vol)吐溫#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步驟4)，洗滌3次，每次3min。10.加二抗，去除步驟4中剩余的PBS后，滴加QDs-IgG復合物探針(由武漢大學化學與分子科學學院合成。謝海燕，龐代文.II-VI型量子點制備及其在生物檢測中應用研究進展.分析化學研究報告，2004，8(32)1099～1103)，稀釋液為含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步驟4)，稀釋后IgG濃度為10μg/ml。濕盒，室溫20-25℃避光孵育1h。11.洗滌玻片，清洗液為含0.5％(vol/vol)吐溫#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步驟4)，避光洗滌3次，每次3min。12.細胞核復染，去除步驟4中的PBS后，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)，稀釋液為含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步驟4)，稀釋后濃度為2μg/ml。濕盒，室溫20-25℃避光染色15～20min。13.洗滌玻片，清洗液為0.01mol/l，pH 7.4，PBS(上述步驟4)，避光洗滌3次，每次3min，緩沖甘油封片，4℃避光保存。14.熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描熒光顯微鏡觀察。本專利技術與現有傳統有機熒光標記技術相比具有以下優點和效果1、成像穩定，在相同的連續激發條件下，本專利技術熒光標記的細胞的熒光半衰期是以異硫氰酸熒光素(FITC)為代表的傳統有機熒光標記的180倍。2、熒光亮度高，本專利技術標記的熒光強度可以達到傳統有機熒光標記(FITC)的5～20倍。3、保存時間長，本專利技術熒光標記的細胞在4℃避光條件下被保存超過一周后，熒光仍然存在，而目前傳統有機熒光標記的標本過夜后熒光基本猝滅。4、標記特異性強，可以克服標本自發熒光的影響。本專利技術與目前國外量子點熒光標記方法相比，不必采用鏈(霉)親和素—生物素系統來進行結合，省略了相關的親和素共價修飾量子點、抗體的生物素化等步驟，整個過程3～4小時即可完成，既簡化了步驟，操作方便，又節省了相關費用，實用性強。附圖說明圖1為本專利技術對人肝癌細胞HCCLM6的免疫熒光標記成像圖，其中圖A 400×，圖B 1000×。按照上述本專利技術和條件，通過共聚焦激光掃描熒光顯微鏡，便得到了清晰的肝癌細胞株HCCLM6 AFP抗原的體外標記成像。明亮的橘紅色熒光部分為被QDs標記的細胞漿中表達AFP本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種穩定標記肝癌細胞的方法，它包括下列步驟為：Ａ、細胞培養人肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ６，培養液為含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培養基，培養條件：３７℃，５％ＣＯ↓［２］／９５％空氣，飽和濕度，隔天更換培養液，每４～６天傳代一次；　 　Ｂ、細胞培養玻片和培養皿的處理，將２０ｍｍ×２０ｍｍ蓋玻片和直徑９ｃｍ的玻璃培養皿用清水洗凈，２％／ｖｏｌ／ｖｏｌ鹽酸溶液浸泡過夜，清水浸泡，用軟毛刷刷洗，烘箱烘干，溫度控制在５０～７０℃，放酸缸內經硫酸１００ｍｌ、重鉻酸鉀１００ｇ、 清潔液蒸餾水１０００ｍｌ浸泡１～３天，自來水沖洗２０次，蒸餾水洗滌１０次，浸泡過夜，烘干后，干烤滅菌，溫度控制在１５０～１７０℃，２ｈ，備用；Ｃ、細胞爬片，將蓋玻片平鋪于培養皿上，每個培養皿鋪４張蓋玻片，用０．１２５％胰蛋白酶消化細 胞，按２×１０↑［６］個／每個培養皿接種，３７℃，５％ＣＯ↓［２］／９５％空氣，飽和濕度培養３ｄ，細胞長滿蓋玻片；Ｄ、洗滌玻片，清洗液為０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．２～７．４、ＰＢＳ（ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．２ｇ 、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２．１６ｇ、蒸餾水１０００ｍｌ），洗滌２次，每次３ｍｉｎ；Ｅ、固定，固定液為－２０℃甲醇，每張玻片３～５ｍｌ，去除上述的剩余ＰＢＳ后固定１５ｍｉｎ；Ｆ、洗滌玻片，清洗 液為０．０１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．２～７．４，ＰＢＳ為上述步驟Ｄ，洗滌３次，每次３ｍｉｎ；Ｇ、封閉，封閉液為含有１％／ｗｔ／ｖｏｌ牛血清白蛋白和０．１％／ｖｏｌ／ｖｏｌ曲拉通Ｘ－１００的ＰＢＳ，ＰＢＳ為上述步驟Ｄ，封閉條件為：濕盒孵育 ，３７℃，２０～３０ｍｉｎ；Ｈ、加一抗，去除上述的剩余封閉液后，滴加鼠抗人ＡＦＰ單克隆抗體，濕盒孵育，３７℃，１～２ｈ或４℃冰箱過夜；Ｉ、洗滌玻片，清洗液為含０．５％／ｖｏｌ／ｖｏｌ吐溫＃２０的ＰＢＳ，ＰＢＳ為上述步驟Ｄ，洗 滌３次，每次３ｍｉｎ；Ｊ、加二抗，去除步驟Ｄ的剩余ＰＢＳ后，滴加ＱＤ↓［ｓ］－ＩｇＧ復合物探針，稀釋液為含５％／ｗｔ／ｖｏｌ牛血清白蛋白的ＰＢＳ，稀釋后ＩｇＧ濃度為１０μｇ／ｍｌ，濕盒，２０～２５℃避光孵育１ｈ；Ｋ、洗滌玻片 ，清洗液為上述步驟Ｉ，ＰＢＳ為上述步驟Ｄ，避光洗滌３次，每次３ｍｉｎ；Ｌ、細胞核復染，去除步驟Ｄ的剩余ＰＢＳ后，滴加４’，６－二...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳良冬，李雁，劉佳，龐代文，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：83[中國|武漢]