一種檢測動物源性食品中氯霉素類藥物的酶聯免疫試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素類藥物的酶聯免疫試劑盒，該酶聯免疫試劑盒包括：包被了氯霉素類藥物抗原或抗抗體的酶標板、氯霉素類藥物鼠單克隆抗體濃縮液、氯霉素類藥物標準品溶液、酶標記物、底物顯色液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、終止液。本發明專利技術還公開了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測氯霉素類藥物的方法，它包括以下步驟：首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發明專利技術提供的檢測動物組織中氯霉素類藥物殘留的酶聯免疫試劑盒及檢測方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現場監控且適合大量樣本篩查。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫學檢測領域，具體地說，涉及一種檢測動物源性食品中氯霉素類藥物的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
氯霉素類藥物(Chloramphenicol，CAP)是應用廣泛的抗菌素，曾對畜禽疾病控制和治療起重要作用。但由于氯霉素類藥物在食品中殘留對人體有嚴重的副作用，能引起人的再生性障礙性貧血，粒細胞缺乏癥等疾病，歐美等發達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。我國農業部第235號文件中規定，動物源性食品中氯霉素的殘留限量為不得檢出。用酶聯免疫測定方法和高效液相色譜分析法(HPLC)檢測時，要求其檢測限均為1ng/kg。由于高效液相色譜分析法和氣譜色譜等儀器分析方法樣本前處理及測定操作煩瑣和費用高，推廣使用受到限制。酶聯免疫測定法具有靈敏度高，特異性強，儀器化程度低和樣本前處理相對簡單等優點，適于現場監控和大量樣本篩查。
技術實現思路
(一)要解決的技術問題本專利技術目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于動物源性食品中氯霉素類藥物的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。(二)技術方案為解決所述問題，本專利技術提供了一種用于檢測動物源性食品中氯霉素類藥物的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒由下列成分組成(1)包被了氯霉素類藥物抗原或抗抗體的酶標板；(2)氯霉素類藥物抗體；(3)氯霉素類藥物標準品溶液；(4)酶標記物； (5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復溶液；(8)終止液。本專利技術中所指的氯霉素類藥物為氯霉素和琥珀氯霉素，或者其它與氯霉素結構相似、具有相同藥理活性的氯霉素類藥物。其中所述的包被了氯霉素類藥物抗原的酶標板在制備的過程中，所用的包被原是用混合酸酐法將氯霉素合成氯霉素類藥物半抗原，再采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)將氯霉素類藥物半抗原與兔血清白蛋白(RSA)偶聯得到的；所用的包被液是pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液是含有3～10％小牛血清和3％惰性蛋白的溶液。其中所述的氯霉素類藥物抗體在制備的過程中的免疫原是采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)將氯霉素類藥物半抗原和甲狀腺蛋白(BCG)進行偶聯得到的，所用的抗體稀釋液是pH值7.4、0.02mol/L、含有1％卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液。本專利技術試劑盒中氯霉素類藥物抗體的蛋白濃度為0.5～5.0μg/L。其中所述的氯霉素類藥物標準品溶液濃度為0～4.05μg/L，可以為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。其中所述酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記氯霉素類藥物抗原，所用的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶；本專利技術優選辣根過氧化物酶。所述標記酶可采用現有技術中的多種方法將其與抗抗體進行偶聯，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本專利技術經過長期的勞動創造將過碘酸鈉法進行了改良，使反應更加省時，并且降低了辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節省了原材料；酶標記氯霉素類藥物抗原是采用混合酸酐法將標記酶與氯霉素類藥物半抗原進行偶聯得到的。當標記酶為辣根過氧化物酶時，其中所述的底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液。其中所述的濃縮洗滌液為含有0.8～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液。其中所述的濃縮復溶液為含有5‰N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液。當標記酶為辣根過氧化物酶時，其中所述的終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸，當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液?？勺鳛楣潭让顾乜乖c載體蛋白的偶聯物或氯霉素類特異性抗體的載體的物質很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。本專利技術還提供了使用上述試劑盒定性、定量檢測動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量的方法，它包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結果。優選地，樣品處理方法為a、動物組織組織樣本(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚)前處理方法均質樣品，稱取均質后的樣品于離心管中，加入乙酸乙酯，振蕩，離心，取出上層液體，在氮氣流下干燥，加入正己烷溶解干燥的殘留物，再加稀釋了的復溶液強烈振蕩，離心，去除上層相，取下層水相進行分析。b、尿液移取尿液到離心管中，加pH4.8、100mM醋酸鈉緩沖液混合，加葡萄糖苷酸酶(Merck，Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時，該溶液恢復至室溫后加入乙酸乙酯混合，離心，取出上層液體在氮氣下50～60℃干燥，用稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，即可進行分析。c、血清血漿取血清或血漿至試管中，加乙酸乙酯上下振蕩，靜置使水相與有機相分層，移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流60℃水浴中吹干，殘留物用稀釋后的復溶液溶解，即可進行分析。d、蜂蜜取蜂蜜，放入離心管中，用去離子水溶解。加入乙酸乙酯上下震蕩，離心，移取上層乙酸乙酯到另一離心管中，50～60℃氮氣流下蒸干，殘留物用稀釋后的復溶液溶解，即可進行分析。優選地，其中試劑盒檢測是向包被有氯霉素類藥物抗原的酶標板微孔中加入標準品溶液或樣品溶液和氯霉素類藥物抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值?；蛘?，是向包被有羊抗鼠抗抗體的酶標板微孔中加入氯霉素類藥物抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標抗原及標準品溶液或樣品溶液，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。優選地，檢測結果分析過程為用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計算公式為百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標準溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值。以氯霉素類藥物濃度的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣品中氯霉素的濃度則可從標準曲線上讀出，根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標準溶液顏色的比較可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍，再根據氯霉素的實際殘留量利用交叉反應率計算出樣本中氯霉素類藥物的實際殘留量。優選地，檢測結果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液中氯霉素類藥物的濃度。優選地，檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。其中，抗原及抗體的制備方法為(1)抗原的合成將氯霉素類藥物分子結構中的醇羥基采用戊二酸酐酰化得到具有氯霉素類藥物官能團的半抗原，再與兔血清白蛋白(RSA)、甲狀腺蛋白(BCG)等載體蛋白采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)在不同的溶劑中進行偶聯得到免疫原。所述合成半抗原的優點為a、突出了氯霉素類藥物母核的分子結構。b、反應產率大大提高，使合成的氯霉素類藥物分子在較溫和的條件下不被分解。c、保留了氯霉素類藥物半抗原分子結構中有較強免疫原性的抗原決定簇——苯本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測動物組織中氯霉素類藥物的試劑盒，其特征在于它包含下列成分：（１）包被了氯霉素類藥物抗原或抗抗體的酶標板；（２）氯霉素類藥物抗體；（３）氯霉素類藥物標準品溶液；（４）酶標記物；（５）底物顯色 液；（６）濃縮洗滌液；（７）濃縮復溶液；（８）終止液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：沈建忠，何方洋，萬宇平，馮才偉，吳小平，馮才茂，汪善良，李軍，趙正苗，張照亮，史為民，張素霞，丁雙陽，羅曉琴，孫倩，
申請(專利權)人：北京望爾生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]