基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法技術(shù)

基于4?羥基?2,6?二氟?1,3,5?苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，涉及多肽環(huán)化方法。先利用DFB在中性或堿性條件下與含有半胱氨酸的多肽發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)合成環(huán)肽；基于以上DFB分子與含巰基多肽的高效生物相容的反應(yīng)性質(zhì)，構(gòu)建噬菌體環(huán)肽庫；在噬菌體上展示含有半胱氨酸的多肽庫，利用DFB對多肽庫進(jìn)行環(huán)化，篩選出具有特異性結(jié)合的環(huán)肽配體。反應(yīng)體系無需加入有機溶劑或金屬催化劑，無需高溫高壓等劇烈條件，適用于生物體系。通過對環(huán)肽反應(yīng)的產(chǎn)率、反應(yīng)速率、環(huán)肽產(chǎn)物穩(wěn)定性等理想的反應(yīng)快速、產(chǎn)率高且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的環(huán)肽方法。針對靶標(biāo)進(jìn)行篩選，得到具有高親和力的環(huán)肽配體，為發(fā)展多肽藥物等提供可能。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法
本專利技術(shù)涉及多肽環(huán)化方法，尤其是涉及一種基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法。
技術(shù)介紹
多肽分子具有易于合成，與靶標(biāo)親和力強，選擇性高等獨特優(yōu)勢，因此被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。線性多肽在溶液中一般無穩(wěn)定構(gòu)象，在與靶標(biāo)蛋白結(jié)合中表現(xiàn)出較弱的結(jié)合能力；其較為松散的結(jié)構(gòu)易于暴露出更多的酶切位點，導(dǎo)致其易被蛋白酶酶解，限制了多肽在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。通過環(huán)化將線性多肽的構(gòu)象固定，不僅可以降低其構(gòu)象自由度，減少其與靶標(biāo)結(jié)合時的熵耗散，提升親和性，還可以將部分酶切位點掩藏在環(huán)內(nèi)部，降低其被酶解的概率，提升抗酶解穩(wěn)定性。自然界中存在著的富含多個二硫鍵的多肽分子，比如芋螺毒素、動物防御素等依靠二硫鍵形成穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗酶解穩(wěn)定性以及特異性結(jié)合靶標(biāo)的能力。(參見O.Saether,D.J.Craik，I.D.Campbell，K.Sletten,D.G.Norman.Biochemistry,1995,34,4147)。但是基于二硫鍵形成的環(huán)肽在還原環(huán)境中不穩(wěn)定，易發(fā)生重排，且大部分不耐受酸堿和強氧化環(huán)境。相比于常見的利用二硫鍵構(gòu)造的環(huán)肽，通過有機分子與多肽內(nèi)氨基酸殘基的偶聯(lián)反應(yīng)形成的硫醚鍵能夠進(jìn)一步提高環(huán)肽的穩(wěn)定性。噬菌體展示技術(shù)是一種基于生物定向進(jìn)化原理的高通量篩選技術(shù)，將環(huán)化方法與生物分子定向進(jìn)化技術(shù)結(jié)合正成為研究及應(yīng)用的新趨勢。目前，用于構(gòu)建噬菌體環(huán)肽庫的共價交聯(lián)的方法主要集中于天然展示二硫鍵的噬菌體環(huán)肽庫與利用翻譯共修飾或翻譯后修飾的方法展示碳硫鍵的噬菌體環(huán)肽庫。后者在拓展結(jié)構(gòu)多樣且高質(zhì)量的噬菌體環(huán)肽庫中展現(xiàn)出巨大潛力，因此被廣泛關(guān)注。噬菌體展示技術(shù)的突出特點是：(i)建立了在同一病毒顆粒內(nèi)表型(展示多肽)與基因型(編碼展示肽的DNA序列)之間的直接聯(lián)系；(ii)巨大的庫容量保證了展示多肽的多樣性。經(jīng)過3～5輪的體外篩選，特異性結(jié)合的噬菌體得到明顯富集。通過挑取富集的單克隆菌落進(jìn)行活化和基因測序，可獲得噬菌體展示的多肽序列，其中重復(fù)或相似的片段稱為“保守序列”。利用固相合成方法(SPPS)合成具有“保守序列”的多肽，通過熒光偏振實驗測定該多肽與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的親和力，獲得具有特異性結(jié)合能力的環(huán)肽配體。由于噬菌體展示反應(yīng)體系的濃度極低，這進(jìn)一步要求環(huán)化方法必須高效且選擇性好。這些要求使得許多化學(xué)合成常用的環(huán)化方法并不適用于定向進(jìn)化技術(shù)中。在中性或堿性條件下，半胱氨酸殘基的巰基具有良好的親核進(jìn)攻活性。利用巰基與芳香鹵代烴的芳香親核取代(SNAr)反應(yīng)，可向多肽中引入一個或多個剛性苯環(huán)平面，將原本靈活的多肽固定在該平面的周圍，降低了構(gòu)象自由度，得到穩(wěn)定的環(huán)肽構(gòu)象，實現(xiàn)多肽穩(wěn)定性與靶標(biāo)親和力的同步提升。Pentelute課題組利用十氟苯分子與多肽在堿性極性有機溶劑DMF中反應(yīng)4.5h(參見AlexanderM.Spokoyny,YekuiZou,JingjingJ.Ling,HongtaoYu,Yu-ShanLin,andBradleyL.Pentelute,J.Am.Chem.Soc.2013,135,5946-5949)，可以得到穩(wěn)定的單取代產(chǎn)物。該方法提出了基于芳香親核取代反應(yīng)，剛性全氟苯芳香烴與多肽中半胱氨酸形成共價鍵穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)。然而，由于全氟苯分子溶解性差，因此反應(yīng)必須在有機溶劑中進(jìn)行，反應(yīng)時間長，不適用于真實生物體系。PeterTimmerman課題組發(fā)現(xiàn)1,3-二(溴甲基)苯分子可在1︰7ACN/NH4CO3溶液中，室溫條件得到環(huán)肽產(chǎn)物(參見PeterTimmerman,*JorisBeld,WouterC.Puijk,RobH.Meloen,ChemBioChem2005,6,821–824)。該方法反應(yīng)耗時短，但體系需兌入有機溶劑輔助反應(yīng)進(jìn)行。隨著現(xiàn)代催化科學(xué)的發(fā)展，將過渡金屬催化的雜原子偶聯(lián)反應(yīng)用于多肽環(huán)化也成為時興熱點。ZacharyT.Ball報道了一種基于硼酸的生物鍵合技術(shù)，利用有機金屬鎳(II)催化的半胱氨酸芳基化偶聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)多肽的環(huán)化(參見KengoHanaya,JunOhata,MaryK.Miller,AliciaE.Mangubat-Medina,MichaelJ.Swierczynski,DavidC.Yang,ReeceM.Rosenthal,BrianV.PoppandZacharyT.Ball，Chem.Commun.,2019,55,2841)。該類反應(yīng)速度快，產(chǎn)率高，但步驟繁瑣，且易存在催化劑殘留的問題。綜上，本領(lǐng)域亟需發(fā)展反應(yīng)迅速、條件溫和、生物相容性好的多肽偶聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建高質(zhì)量噬菌體庫，創(chuàng)造特異性結(jié)合能力好的環(huán)肽配體，為發(fā)展多肽藥物、檢測、診療提供更多可能。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于針對傳統(tǒng)的基于二硫鍵環(huán)肽策略存在的還原性條件下不穩(wěn)定等難題，同時針對現(xiàn)有基于有機分子環(huán)肽策略中存在的反應(yīng)條件苛刻，溶解度低和化學(xué)毒性高等問題，提供生物相容好、反應(yīng)條件溫和、無需催化劑和有機溶劑，且反應(yīng)迅速完全的高效、簡單、綠色的一種基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法。本專利技術(shù)包括以下步驟：1)利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)在中性或堿性條件下與含有半胱氨酸的多肽發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)合成環(huán)肽；2)基于以上4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)分子與含巰基多肽的高效生物相容的反應(yīng)性質(zhì)，構(gòu)建噬菌體環(huán)肽庫；在噬菌體上展示含有半胱氨酸的多肽庫，利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)對多肽庫進(jìn)行環(huán)化，篩選出具有特異性結(jié)合的環(huán)肽配體。在步驟1)中，所述合成環(huán)肽的具體方法可為：將含有半胱氨酸的多肽粉末溶于溶劑中得到多肽溶液A，將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B；在中性或堿性緩沖溶液中，加入多肽溶液A與硫醇還原劑，使多肽充分還原后，加入溶液B，反應(yīng)得到環(huán)肽產(chǎn)物，用高效液相色譜與質(zhì)譜分析及表征產(chǎn)物；所述含有半胱氨酸的多肽的序列為-CXnC-，其中C代表半胱氨酸，Xn代表n個隨機氨基酸；所述溶劑可采用水、乙腈或二甲亞砜等中的一種；所述將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B可將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末用乙腈溶解得到濃度為0.5mol/L的溶液B，用水稀釋至50mmol/L、5mmol/L備用；所述硫醇還原劑可采用三(2-羧乙基)膦鹽(TCEP)等，所述多肽溶液A與硫醇還原劑中還原劑與多肽的比例≥1︰1；所述中性或緩沖溶液為pH≥7.0磷酸鹽或碳酸鹽緩沖溶液；所述溶液B與多肽的比例≥1︰1；所述反應(yīng)的溫度可為20～50℃，反應(yīng)的時間可為5min～12h。在步驟2)中，所述在噬菌體上展示含有半胱氨酸的多肽庫，利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)對多肽庫進(jìn)行環(huán)化，篩選出具有特異性結(jié)合的環(huán)肽配體的具體方法可為：(1)向滴度大于1013p本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于包括以下步驟：/n1)利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈在中性或堿性條件下與含有半胱氨酸的多肽發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)合成環(huán)肽；/n2)基于以上4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈分子與含巰基多肽的高效生物相容的反應(yīng)性質(zhì)，構(gòu)建噬菌體環(huán)肽庫；在噬菌體上展示含有半胱氨酸的多肽庫，利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈對多肽庫進(jìn)行環(huán)化，篩選出具有特異性結(jié)合的環(huán)肽配體。/n

【技術(shù)特征摘要】
1.基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于包括以下步驟：
1)利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈在中性或堿性條件下與含有半胱氨酸的多肽發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)合成環(huán)肽；
2)基于以上4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈分子與含巰基多肽的高效生物相容的反應(yīng)性質(zhì)，構(gòu)建噬菌體環(huán)肽庫；在噬菌體上展示含有半胱氨酸的多肽庫，利用4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈對多肽庫進(jìn)行環(huán)化，篩選出具有特異性結(jié)合的環(huán)肽配體。


2.如權(quán)利要求1所述基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于在步驟1)中，所述含有半胱氨酸的多肽的序列為-CXnC-，其中C代表半胱氨酸，Xn代表n個隨機氨基酸。


3.如權(quán)利要求1所述基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于在步驟1)中，所述合成環(huán)肽的具體方法為：將含有半胱氨酸的多肽粉末溶于溶劑中得到多肽溶液A，將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B；在中性或堿性緩沖溶液中，加入多肽溶液A與硫醇還原劑，使多肽充分還原后，加入溶液B，反應(yīng)得到環(huán)肽產(chǎn)物，用高效液相色譜與質(zhì)譜分析及表征產(chǎn)物。


4.如權(quán)利要求3所述基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于所述溶劑采用水、乙腈或二甲亞砜中的一種；所述將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B可將2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末用乙腈溶解得到濃度為0.5mol/L的溶液B，用水稀釋至50mmol/L、5mmol/L備用。


5.如權(quán)利要求3所述基于4-羥基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈構(gòu)建噬菌體展示環(huán)肽庫的方法，其特征在于所述硫醇還原劑采用三(2-羧乙基)膦鹽(TCEP)；所述中性或緩沖溶液為pH≥7.0磷酸鹽或碳酸鹽緩沖溶液。


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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳川六，鄭雪鈞，劉威東，劉紫艷，
申請(專利權(quán))人：廈門大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35