構建RRBS文庫的Y型接頭、試劑盒及方法技術

本發明專利技術提供了一種構建RRBS文庫的Y型接頭、試劑盒及方法。該Y型接頭包括：甲基化接頭1：5'?acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1?3'；甲基化接頭2：5'?n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac?3'；其中，甲基化接頭1和甲基化接頭2退火形成Y型接頭，甲基化接頭1和甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c，n1和n1’為互補配對的保護堿基序列，n1或n1’的堿基數目為6～12個，n2為酶切位點粘性末端堿基，n2的堿基數目為1～5個。該接頭有助于提高測序數據產出，同時提高酶切效率的評估及其準確性。

【技術實現步驟摘要】
構建RRBS文庫的Y型接頭、試劑盒及方法
本專利技術涉及分子育種領域，具體而言，涉及一種構建RRBS文庫的Y型接頭、試劑盒及方法。
技術介紹
RRBS(Reducedrepresentationbisulfitesequencing)，即簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術，是一種用于基因組單核苷酸級別的甲基化水平分析的高效的高通量測序技術。其原理即利用限制性內切酶MspI與片段選擇相結合的方式富集基因組中高GC區域，再通過亞硫酸氫鹽測序方法，得到基因組單核苷酸級別的甲基化水平分析結果。目前的建庫方案由以下幾個步驟組成：酶切---純化---末端修復加A尾---連接接頭---CT轉化---回收目的片段。然而，現有的方法所構建的文庫獲得測序數據后，通過生物信息學對酶切效率進行評估時，往往出現評估結果偏低的狀況。對于此種狀況，現有技術中尚無有效的解決方案。
技術實現思路
本專利技術的主要目的在于提供一種構建RRBS文庫的Y型接頭、試劑盒及方法，以解決現有技術中酶切效率評估結果偏低的缺陷。為了實現上述目的，根據本專利技術的一個方面，提供了一種用于甲基化文庫構建的Y型接頭，該Y型接頭包括：甲基化接頭1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；甲基化接頭2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；其中，甲基化接頭1和甲基化接頭2退火形成Y型接頭，甲基化接頭1和甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c，n1和n1’為互補配對的保護堿基序列，n1或n1’的堿基數目為6～12個，n2為酶切位點粘性末端堿基，n2的堿基數目為1～5個。進一步地，保護堿基序列為6～8個隨機堿基形成的序列。進一步地，n2的堿基數目為2～4個。進一步地，酶切位點粘性末端堿基為MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切產生的末端堿基。進一步地，甲基化接頭1為：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；甲基化接頭2為：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3',其中，甲基化接頭1和甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c。為了實現上述目的，根據本專利技術的第二個方面，提供了一種構建RRBS文庫的方法，該方法包括：采用內切酶及上述任一種Y型接頭，對待測基因組DNA進行邊酶切邊連接接頭，得到帶接頭片段；對帶接頭片段進行片段長度選擇，得到目標長度片段；對目標長度片段進行CT轉化，得到轉化片段；對轉化片段進行PCR擴增，得到RRBS文庫。進一步地，采用電泳切膠回收的方法對帶接頭片段進行片段長度選擇，得到目標長度片段。進一步地，對轉化片段進行PCR擴增后，還包括對PCR擴增產物進行純化，從而得到RRBS文庫。根據本專利技術的第三個方面，提供了一種構建RRBS文庫的試劑盒，該試劑盒包括Y型接頭，Y型接頭為上述任一種Y型接頭。進一步地，試劑盒還包括核酸內切酶，該核酸內酶產生的粘性末端的堿基與前述Y型接頭中n2所示的酶切位點粘性末端堿基相同。應用本專利技術的技術方案，一方面通過增加與測序引物的第一個堿基互補配對的堿基T，使得測序引物測得的第一個堿基為N的概率降低，提高測序數據產出，有助于提高酶切效率的評估及其準確性。另一方面通過增加保護堿基，使得酶切位點相關的堿基的測序質量相對較高，進而提高酶切效率評估結果及其準確性。此外，將Y型接頭的3’末端改為酶切位點的粘性末端堿基，從而既減少了現有此類文庫構建方法中需要在酶切后先進行純化，再進行末端修復加A尾，再連接頭的繁瑣步驟(實驗步驟減少3個、時間上相較于原來縮短3h)，又避免了末端修復過程中的錯配，進而使得接頭連接后保持酶切位點序列堿基的準確性，進而提高酶切效率評估結果的準確性。具體實施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本專利技術。如
技術介紹
所提到的，現有的RRBS文庫構建的方法通過限制性內切酶，在酶切后通過末端修復加A尾，然后再利用A與接頭末端T堿基互補配對的方法加上接頭。專利技術人經分析發現，這種建庫方法在末端修復加A的過程中會出現錯配，而文庫測序產生的測序數據在進行生物信息分析時，會根據酶切位點的堿基序列來評估酶切效率，因而這種末端修復產生的錯配會降低酶切效率的評估結果。針對上述原因，專利技術人對現有的Y型接頭的結構進行了改進，具體思路如下：現有的小Y型接頭+T(測序引物最后一個堿基與之互補配對，若去掉容易導致產出降低、測序第一個堿基位點含N，會大大降低酶切效率的評估)+堿基保護序列(通常測序前6個堿基的測序質量低，影響鏈接效率的評估和比對(mapping)計算，因此可以加上6個堿基的保護序列，但具體數目可以適當調整)+酶切位點粘性末端堿基(可以是3個，也可以根據不同的酶切位點比如，BglII、XmaI、TaqI做出調整)。并經過實驗驗證，改進后的Y型接頭能夠大大提高酶切效率的評估結果，從而使得評估結果更接近真實情況。基于上述研究結果，申請人提出了本申請的改進方案。在本申請一種典型的實施方式中，提供了一種用于甲基化文庫構建的Y型接頭，Y型接頭包括：甲基化接頭1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'(SEQIDNO:1)；甲基化接頭2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'(SEQIDNO:2)；其中，甲基化接頭1和甲基化接頭2退火形成Y型接頭，甲基化接頭1和甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c，n1和n1’均為互補配對的保護堿基序列，n1或n1’的堿基數目為6～12個，n2為酶切位點粘性末端堿基，n2的堿基數目為1～5個。上述甲基化接頭1中的前32位堿基和甲基化接頭2中的后33位堿基，為現有的Y型接頭序列中的一部分。甲基化接頭1中的第33位堿基t和甲基化接頭2中從3'端數第34位堿基a，是為了便于使測序引物的最后一個堿基與接頭互補配對，該堿基的存在有助于提高數據產出，降低測序第一個堿基為N的概率，從而提高酶切效率評估結果的準確性。通過增加保護堿基，使得酶切位點相關的堿基的測序質量相對較高，進而提高酶切效率評估結果及其準確性。此外，將Y型接頭的3’末端改為酶切位點的粘性末端堿基，從而既減少了現有此類文庫構建方法中需要在酶切后先進行純化，再進行末端修復加A尾，再連接頭的繁瑣步驟(實驗步驟減少3個、時間上相較于原來縮短3h)，又避免了末端修復過程中的錯配，進而使得接頭連接后保持酶切位點序列堿基的準確性，進而提高酶切效率評估結果的準確性。上述Y型接頭中，保護堿基序列的具體長度雖然優選是6個堿基以上的，比如，優選為6～8個隨機堿基形成的隨機序列。但本申請也不排除在某些特殊情況下，也可以是少于6個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種構建RRBS化文庫的Y型接頭，其特征在于，所述Y型接頭包括：/n甲基化接頭1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；/n甲基化接頭2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；/n其中，所述甲基化接頭1和所述甲基化接頭2退火形成所述Y型接頭，所述甲基化接頭1和所述甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c，n1和n1’為互補配對的保護堿基序列，n1或n1’的堿基數目為6～12個，n2為酶切位點粘性末端堿基，n2的堿基數目為1～5個。/n

【技術特征摘要】
1.一種構建RRBS化文庫的Y型接頭，其特征在于，所述Y型接頭包括：
甲基化接頭1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；
甲基化接頭2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；
其中，所述甲基化接頭1和所述甲基化接頭2退火形成所述Y型接頭，所述甲基化接頭1和所述甲基化接頭2中的堿基c均為甲基化修飾的c，n1和n1’為互補配對的保護堿基序列，n1或n1’的堿基數目為6～12個，n2為酶切位點粘性末端堿基，n2的堿基數目為1～5個。


2.根據權利要求1所述的Y型接頭，其特征在于，所述保護堿基序列為6～8個隨機堿基形成的序列。


3.根據權利要求1所述的Y型接頭，其特征在于，所述n2的堿基數目為2～4個。


4.根據權利要求1所述的Y型接頭，其特征在于，所述酶切位點粘性末端堿基為MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切產生的末端堿基。


5.根據權利要求1所述的Y型接頭，其特征在于，
所述甲基化接頭1為：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；
所述甲基化接頭2為：5'-cgctgc...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭松，孔維茜，李彪，騫蕾陽，吳國營，沈世超，
申請(專利權)人：天津諾禾醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12