超高效液相色譜串聯質譜測定血漿中AMG 510濃度的方法技術

本發明專利技術公開了一種超高效液相色譜串聯質譜測定血漿中分子靶向藥AMG 510濃度的方法，包括：配制標準曲線工作液，配制內標物工作液；將0?5μL標準曲線工作液分別加入空白血漿補足至20μL，渦旋制成標準曲線血漿樣品，加入內標物工作液和甲醇，渦旋，離心，取上清液，進行UPLC?MS/MS定量分析，繪制標準曲線；精密吸取20μL的待測血漿，樣本前處理方法同上，按照當批次的標準曲線測定AMG 510的濃度。本發明專利技術首次測定抗非小細胞肺癌分子靶向藥物AMG 510的血藥濃度，靈敏度高、專屬性強、快速、重現性好，可進一步推廣至臨床高通量檢測或監測AMG 510濃度，提高癌癥患者的獲益風險比。

【技術實現步驟摘要】
超高效液相色譜串聯質譜測定血漿中AMG510濃度的方法
本專利技術涉及檢測藥物濃度的方法。更具體地說，本專利技術涉及一種超高效液相色譜串聯質譜測定血漿分子靶向藥AMG510濃度的方法。
技術介紹
近年來，隨著抗腫瘤分子靶向藥物在臨床廣泛應用，以表皮生長因子受體(EGFR)、間變淋巴瘤激酶(ALK)重排、血管內皮生長因子受體(VEGFR)等為代表的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)顯著提高了晚期癌癥患者的獲益風險比。KRAS基因位于12號染色體，是RAS家屬的一個原癌基因，是細胞內信號傳導通路中重要的“開關”。一旦它打開，將會活化多種分裂、增殖因子，包括c-Raf和PI3K。正常情況下，KRAS會和GTP結合，把GTP的最末一個磷酸基切掉，讓它變成GDP。在把GTP變成GDP后，KRAS就關閉失活。但是KRAS基因突變后，KRAS蛋白持續保持活化狀態，不再依賴上級信號的刺激，處于與GTP持續結合的狀態，導致下游的信號通路異常活躍，從而促進細胞的生長與增值。KRAS突變位點作為最常見的致癌基因之一，存在于約25％的所有癌癥中。其中KRAS(G12C)占所有KRAS突變的40％以上，且在肺癌中高度顯性(約占13％)。AMG510是首個針對KRAS(G12C)基因突變的晚期癌癥患者中進行臨床試驗的抑制劑。早期研究結果表明，在非小細胞肺癌(NSCLC)中，90％的患者疾病可得到控制(n＝10)，5例患者接受AMG510治療后腫瘤縮小，另外4例腫瘤停止生長。隨訪了34例NSCLC患者，在可評價有效性隊列13例患者中7例患者獲得部分緩解，6例患者疾病穩定，提示疾病控制率為100％。另外，臨床前研究結果顯示，AMG510與PD-1抑制劑聯用后免疫活性小鼠腫瘤生長受到顯著抑制，提示兩者聯用可能發揮協同作用。目前，AMG510正在進行臨床Ⅱ-Ⅲ期研究，尚無更多有效性數據披露。眾所周知，血漿藥物濃度及暴露量信息對于評價藥物的有效性、安全性及耐受性至關重要。藥物濃度是發揮藥效的基礎，同時也是導致藥物療效不佳、毒性增大的重要因素之一。通過定期監測患者的血藥濃度有助于預測療效及可能的不良反應，顯著提高患者的獲益風險比、從而實現個體化精準用藥。然而，關于AMG510的超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)定量檢測方法未見報道。因此，建立一種準確、快速、高通量的方法用于測定血中AMG510藥物濃度是非常必要和需要的。為滿足臨床前和臨床高通量檢測、血藥濃度監測的要求，本領域亟需無特殊的設備要求、高通量、樣品需求少、方便、快速的測定AMG510濃度的UPLC-MS/MS方法。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。本專利技術還有一個目的是提供一種超高效液相色譜串聯質譜測定血漿分子靶向藥AMG510濃度的方法，將為后續臨床常規治療藥物監測奠定技術基礎。為了實現根據本專利技術的這些目的和其它優點，提供了一種超高效液相色譜串聯質譜測定血漿AMG510濃度的方法，包括：采用甲醇溶解AMG510配制多個濃度的標準曲線工作液，采用甲醇溶解卡馬西平內標物配制成內標物工作液；將0-5μL的AMG510多個濃度的標準曲線工作液分別加入大鼠空白血漿補足至20μL，渦旋制成多個濃度的標準曲線血漿樣品，加入10μL內標物工作液和50μL甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，以血漿樣品中AMG510濃度為橫坐標，以峰面積與卡馬西平內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制線性范圍分別為0.5-500ng/mL的標準曲線；精密吸取20μL的待測血漿，加入繪制標準曲線時等量的內標物工作液、甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，在所述標準曲線上讀取測得的AMG510峰面積與內標物峰面積的比值對應的AMG510濃度；液相條件為：色譜柱為WatersXBrigeC18，內徑2.1mm、柱長50mm、粒徑3.5mm，流速0.4mL/min，進樣體積2μL，分析時間3min，柱溫為40℃，洗針溶液為體積比為1:1:1:1的異丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流動相的有機相為含有質量分數為0.1％的甲酸的乙腈，水相為含有質量分數為0.1％的甲酸的水，梯度洗脫設置為0-0.1min、0.1-1.2min、1.2-2.2min、2.2-3min有機相與水相的體積比分別為1:9、9:1、1:0、1:9；質譜條件為：采用電噴霧離子源的多反應監測模式，正離子掃描模式，多反應監測模式，AMG510的母、子離子對的質荷比為m/z561.4→317.1(定性)、m/z561.4→134.1(定量)、內標的母、子離子對的質荷比為m/z237.0→194.1，每個多反應監測模式通道的掃描時間為200ms，質譜的離子化溫度為550℃、氣簾氣20psi、霧化氣和輔助氣均為55psi、離子化電壓為5500V、入口電壓為10eV、碰撞室出口電壓為13eV。優選的是，采用甲醇溶解AMG510配制成濃度為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的標準曲線工作液，采用甲醇溶解卡馬西平內標物配制成濃度為10ng/mL的內標物工作液。優選的是，精密吸取2μL標準曲線工作液，加入18μL空白血漿，加入10μL內標物工作液。優選的是，渦旋震蕩1min，4℃下13500rpm離心10min。優選的是，采用甲醇溶解AMG510配制多個濃度的質控工作液，采用甲醇溶解卡馬西平內標物配制成內標物工作液；將0-5μL多個濃度的質控工作液分別加入空白血漿補足至20μL，渦旋制成多個濃度的質控血漿樣品，加入10μL內標物工作液和50μL甲醇渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，校正所述標準曲線，使至少2/3的質控樣品的準確度在標示值的±15％內，且每一濃度水平至少50％樣品應符合這一標準。優選的是，采用甲醇溶解AMG510配制成濃度為10ng/mL、200ng/mL、4μg/mL的質控工作液。優選的是，精密吸取2μL質控工作液，加入18μL空白血漿，加入10μL內標物工作液和50μL甲醇。本專利技術至少包括以下有益效果：第一、AMG510是一種酞嗪類化合物，其化學名稱為4-[(S)-4-丙烯酰-2-甲基哌嗪-1-基]-6-氟-7-(2-氟-6-羥基苯基)-1-(2-異丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶(2.3-d)嘧啶-2(1H)-酮，分子式為C30H30F2N6O3，相對分子質量為560.59。AMG510通過特異地、不可逆地將KRAS鎖定在非活躍的GDP結合狀態，破解了“KRAS不可成藥”魔咒。基于該化合物本身的特殊性及盡可能全面定量AMG510的血藥濃度，本專利技術通過逐個優化色譜分離條件，克服了定量測定過程中的諸多關鍵環節。例如，通過添加不同的流動相調節劑獲得最佳的色譜峰。本專利技術嘗試了文獻報道的三氟乙酸和乙酸銨等添加劑，但是結本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.超高效液相色譜串聯質譜測定血漿AMG 510濃度的方法，其特征在于，包括：/n采用甲醇溶解AMG 510配制多個濃度的標準曲線工作液，采用甲醇溶解卡馬西平內標物配制成內標物工作液；/n將0-5μL的AMG 510多個濃度的標準曲線工作液分別加入大鼠空白血漿補足至20μL，渦旋制成多個濃度的標準曲線血漿樣品，加入10μL內標物工作液和50μL甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，以血漿樣品中AMG 510濃度為橫坐標，以峰面積與卡馬西平內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制線性范圍分別為0.5-500ng/mL的標準曲線；/n精密吸取20μL的待測血漿，加入繪制標準曲線時等量的內標物工作液、甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，在所述標準曲線上讀取測得的AMG 510峰面積與內標物峰面積的比值對應的AMG 510濃度；/n液相條件為：色譜柱為Waters XBrige C

【技術特征摘要】
1.超高效液相色譜串聯質譜測定血漿AMG510濃度的方法，其特征在于，包括：
采用甲醇溶解AMG510配制多個濃度的標準曲線工作液，采用甲醇溶解卡馬西平內標物配制成內標物工作液；
將0-5μL的AMG510多個濃度的標準曲線工作液分別加入大鼠空白血漿補足至20μL，渦旋制成多個濃度的標準曲線血漿樣品，加入10μL內標物工作液和50μL甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，以血漿樣品中AMG510濃度為橫坐標，以峰面積與卡馬西平內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制線性范圍分別為0.5-500ng/mL的標準曲線；
精密吸取20μL的待測血漿，加入繪制標準曲線時等量的內標物工作液、甲醇，渦旋，0-4℃下離心，取上清液，進行UPLC-MS/MS定量分析，在所述標準曲線上讀取測得的AMG510峰面積與內標物峰面積的比值對應的AMG510濃度；
液相條件為：色譜柱為WatersXBrigeC18，內徑2.1mm、柱長50mm、粒徑3.5mm，流速0.4mL/min，進樣體積2μL，分析時間3min，柱溫為40℃，洗針溶液為體積比為1:1:1:1的異丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流動相的有機相為含有質量分數為0.1％的甲酸的乙腈，水相為含有質量分數為0.1％的甲酸的水，梯度洗脫設置為0-0.1min、0.1-1.2min、1.2-2.2min、2.2-3min有機相與水相的體積比分別為1:9、9:1、1:0、1:9；
質譜條件為：采用電噴霧離子源的多反應監測模式，正離子掃描模式，多反應監測模式，AMG510的母、子離子對的質荷比為m/z561.4→317.1(定性)、m/z561.4→134.1(定量)、內標的母、子離子對的質荷比為m/z237.0→194.1，每個多反應監測模式通道的掃描時間為200ms，質譜的離子化溫度為550℃、氣簾氣20psi、霧化氣和輔助氣均為55psi、離子化電壓為5500V、入口電壓為10eV、碰撞室出口電壓為13eV...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉麗宏，杜萍，安卓玲，王國永，
申請(專利權)人：首都醫科大學附屬北京朝陽醫院，
類型：發明
國別省市：北京;11