生物體液中糖皮質激素的液相色譜串聯質譜檢測方法技術

本發明專利技術公開一種生物體液中糖皮質激素的液相色譜質譜聯用的檢測方法，包括：(1)樣本進行蛋白沉淀和固液萃取板前處理，得供試品溶液和對照品溶液；(2)液相色譜質譜聯用檢測：色譜柱采用反相C12色譜柱；流動相A為有機酸鹽水溶液：乙腈＝9:1；流動相B為有機酸鹽水溶液：乙腈＝1:9；采用梯度洗脫。本發明專利技術的方法能夠有效檢出人尿液和血清中糖皮質激素，具有分離效果好，基線平穩，檢測時間短，線性好，準確度高，重現性好，靈敏度高，精密度高的特點。

【技術實現步驟摘要】
生物體液中糖皮質激素的液相色譜串聯質譜檢測方法
本專利技術涉及醫學檢測
，具體涉及一種生物體液中糖皮質激素的液相色譜串聯質譜檢測方法。
技術介紹
糖皮質激素屬于類固醇家族，它具有重要的糖、蛋白質和鈣代謝功能。合成糖皮質激素應用也廣泛，其作為消炎藥和免疫抑制劑具有重要的臨床應用價值。但這些藥物的應用也可能有一些其他非預期的臨床表現。暴露于這些類固醇的患者可能出現庫欣綜合征的臨床特征，但其皮質醇水平下降，且下丘腦-垂體-腎上腺軸呈現抑制情況。糖皮質激素的活性在很大程度上依賴于核素上的取代基，取代基已被發現可顯著增加糖皮質激素和礦物質皮質激素的活性。因此對人體液(如血清和尿液)中多種合成糖皮質激素藥物濃度進行同時監測具有重要的意義。目前用于生物體液中多種合成糖皮質激素檢測的方法主要有高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、液相色譜質譜聯用(LC-MS)和電化學發光(EC)，其中LC-MS由于具有低檢出限、寬線性范圍等特點而成為檢測糖皮質激素強有力的手段。合成糖皮質激素主要包括地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮質醇、可的松、氟氫可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、潑尼松龍、潑尼松、和曲安奈德十二種。在LC-MS檢測之前通常需要采用適當的樣品前處理方法對樣本進行基質去除，現有的LC-MS檢測方法存在分析方法耗時長、或準確性及可靠性較差、或精密度較、不易于批量處理等缺點。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于，提供一種液質聯用檢測生物體液中糖皮質激素的方法，該方法具有簡單快速、前處理耗時短、精密度和靈敏度高、重現性好的特點。為解決上述技術問題，本專利技術提供一種生物體液中糖皮質激素的液相色譜質譜聯用的檢測方法，包括：(1)溶液配置和樣本前處理：配制一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液及一定濃度的糖皮質激素內標溶液；對添加了糖皮質激素內標溶液的生物體液樣本進行蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前處理，得供試品溶液；對添加了糖皮質激素內標溶液的一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液進行蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前處理，得對照品溶液；所述蛋白沉淀和固液萃取板(SLE)前處理的過程為：取一定體積的溶液分別用適量水稀釋，然后進行振蕩混勻、離心沉淀蛋白；將離心后的溶液分別轉移至填充硅藻土吸附劑的固相萃取板(SLE)中，用二氯甲烷洗脫，收集洗脫液并吹干，然后用一定體積的雌三醇溶液復溶；所述糖皮質激素包括地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮質醇、可的松、氟氫可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、潑尼松龍、潑尼松、和曲安奈德十二種；(2)液相色譜質譜聯用檢測：其中，液相色譜條件為：色譜柱采用反相C12色譜柱；流動相包括流動相A和流動相B；流動相A為含0.05～0.15mMmM有機酸鹽的水：乙腈＝9:1的混合溶液；流動相B為含0.05～0.15mMmM有機酸鹽的水：乙腈＝1:9的混合溶液：乙腈＝1:9的混合溶液；采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在20～30％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由20～30％增至55～65％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由55～65％遞增至85～95％；8.68～9.18min，流動相B體積百分比保持為85～95％；9.18～9.20min，流動相B體積百分比由85～95％遞減至20～30％；9.20～10.00，流動相B保持體積百分比為20～30％；質譜條件為：離子源為電噴霧離子源；離子模式為正離子模式；監測模式為多反應監測模式；(3)定量測定方法：將所述對照品溶液以及供試品溶液按所述(2)色譜條件依次進樣，記錄色譜圖；將對照品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值與各糖皮質激素濃度分別進行線性回歸產生標準曲線和/或擬合方程；將供試品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值代入至所述標準曲線和/或擬合方程，得出生物體液中各糖皮質激素濃度。具體的，所述生物體液為尿液樣本和血液樣本。優選的，所述血液樣本為血清。優選的，所述生物體液來源于人體。在一個優選的實施例中，所述步驟(1)中，所述固相萃取板的類型為96孔深孔板。在一個優選的實施例中，所述步驟(1)中，洗脫操作中，使用二氯甲烷洗脫三次。在一個優選的實施例中，所述步驟(1)中，吹干方式為使用氮氣吹干。吹干的溫度為40±2℃。在一個優選的實施例中，所述步驟(1)中，所述雌三醇溶液為體積百分濃度0.05～0.5％雌三醇的70％甲醇水溶液；更優選的，所述甲酸水溶液的體積百分濃度0.1～0.3％雌三醇的70％甲醇水溶液；更優選的，所述甲酸水溶液的體積百分濃度0.1％雌三醇的70％甲醇水溶液。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，流動相A中的有機酸鹽選自乙酸銨或甲酸胺。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，流動相A中有機酸鹽濃度為0.1mM。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，流動相B中的有機酸鹽選自乙酸銨或甲酸胺。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，流動相B中有機酸濃度為0.1mM。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在23～27％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由23～27％增至58～62％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由58～62％遞增至88～92％；8.68～9.18min，流動相B體積百分比保持為88～92％；9.18～9.20min，流動相B體積百分比由88～92％遞減至23～27％；9.20～10.00，流動相B保持體積百分比為23～27％。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在25％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由25％增至60％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由60％遞增至90％；8.68～9.18min，流動相B體積百分比保持為90％；9.18～9.20min，流動相B體積百分比由90％遞減至25％；9.20～10.00，流動相B保持體積百分比為25％。在一個優選的實施例中，所述步驟(2)中，色譜柱為PhenomenexSynergiTM4μmMax-RP50x4.6mm，4μm。在一個具體的實施例中，所述步驟(2)中，液相色譜的柱溫為25.0～55.0℃。在一個優選的實施例中，柱溫為48.0～55.0℃。在一個優選的實施例中，柱溫為50.0℃。在一個具體的實施例中，所述步驟(2)中，液相色譜的進樣量為0.5～20.0μL。在一個優選的實施例中，進樣量為5.0～15.0μL。在一個優選的實施例中，進樣量為10.0μL。在一個具體的實施例中，所述步驟(2)中，液相色譜的流動相的流速為0.1～2.0mL/min。在一個優選的實施例中，流速為0.3～1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種生物體液中糖皮質激素的液相色譜質譜聯用的檢測方法，其特征在于，包括：/n(1)溶液配置和樣本前處理：/n配制一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液及一定濃度的糖皮質激素內標溶液；/n對添加了糖皮質激素內標溶液的生物體液樣本進行蛋白沉淀和固液萃取板前處理，得供試品溶液；對添加了糖皮質激素內標溶液的一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液進行蛋白沉淀和固液萃取板前處理，得對照品溶液；/n所述蛋白沉淀和固液萃取板前處理的方法為：取一定體積的溶液用適量水稀釋，然后進行振蕩混勻、離心沉淀蛋白；將離心后的溶液分別轉移至填充硅藻土吸附劑的固相萃取板中，用二氯甲烷洗脫，收集洗脫液并吹干，然后用一定體積的雌三醇溶液復溶；/n所述糖皮質激素包括：地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮質醇、可的松、氟氫可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、潑尼松龍、潑尼松、和曲安奈德十二種；/n(2)液相色譜質譜聯用檢測：/n其中，液相色譜條件為：色譜柱采用反相C12色譜柱；流動相包括流動相A和流動相B；流動相A為含0.05～0.15mM有機酸鹽水溶液：乙腈＝9:1的混合溶液；流動相B為含0.05～0.15mM有機酸鹽水溶液：乙腈＝1:9的混合溶液；采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在20～30％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由20～30％增至55～65％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由55～65％遞增至85～95％；8.68～9.18min，流動相B體積百分比保持為85～95％；9.18～9.20min，流動相B體積百分比由85～95％遞減至20～30％；9.20～10.00，流動相B保持體積百分比為20～30％；/n質譜條件為：離子源為電噴霧離子源；離子模式為正離子模式；監測模式為多反應監測模式；/n(3)定量測定方法：/n將所述對照品溶液以及供試品溶液按所述(2)色譜條件依次進樣，記錄色譜圖；將對照品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值與各糖皮質激素濃度分別進行線性回歸產生標準曲線和/或擬合方程；將供試品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值代入至所述標準曲線和/或擬合方程，得出生物體液中各糖皮質激素濃度。/n...

【技術特征摘要】
1.一種生物體液中糖皮質激素的液相色譜質譜聯用的檢測方法，其特征在于，包括：
(1)溶液配置和樣本前處理：
配制一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液及一定濃度的糖皮質激素內標溶液；
對添加了糖皮質激素內標溶液的生物體液樣本進行蛋白沉淀和固液萃取板前處理，得供試品溶液；對添加了糖皮質激素內標溶液的一系列濃度梯度的糖皮質激素標準溶液進行蛋白沉淀和固液萃取板前處理，得對照品溶液；
所述蛋白沉淀和固液萃取板前處理的方法為：取一定體積的溶液用適量水稀釋，然后進行振蕩混勻、離心沉淀蛋白；將離心后的溶液分別轉移至填充硅藻土吸附劑的固相萃取板中，用二氯甲烷洗脫，收集洗脫液并吹干，然后用一定體積的雌三醇溶液復溶；
所述糖皮質激素包括：地塞米松、倍他米松、布地奈德、皮質醇、可的松、氟氫可的松、丙酸氟替卡松、醋酸甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、潑尼松龍、潑尼松、和曲安奈德十二種；
(2)液相色譜質譜聯用檢測：
其中，液相色譜條件為：色譜柱采用反相C12色譜柱；流動相包括流動相A和流動相B；流動相A為含0.05～0.15mM有機酸鹽水溶液：乙腈＝9:1的混合溶液；流動相B為含0.05～0.15mM有機酸鹽水溶液：乙腈＝1:9的混合溶液；采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在20～30％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由20～30％增至55～65％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由55～65％遞增至85～95％；8.68～9.18min，流動相B體積百分比保持為85～95％；9.18～9.20min，流動相B體積百分比由85～95％遞減至20～30％；9.20～10.00，流動相B保持體積百分比為20～30％；
質譜條件為：離子源為電噴霧離子源；離子模式為正離子模式；監測模式為多反應監測模式；
(3)定量測定方法：
將所述對照品溶液以及供試品溶液按所述(2)色譜條件依次進樣，記錄色譜圖；將對照品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值與各糖皮質激素濃度分別進行線性回歸產生標準曲線和/或擬合方程；將供試品溶液中各糖皮質激素對其內標物的峰面積的比值代入至所述標準曲線和/或擬合方程，得出生物體液中各糖皮質激素濃度。


2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述生物體液為尿液樣本和血液樣本。


3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述固相萃取板的類型為96孔深孔板。


4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述雌三醇溶液為體積百分濃度0.05～0.5％雌三醇的70％甲醇水溶液；更優選的，所述甲酸水溶液的體積百分濃度0.1～0.3％雌三醇的70％甲醇水溶液；更優選的，所述甲酸水溶液的體積百分濃度0.1％雌三醇的70％甲醇水溶液。


5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，流動相A中的有機酸鹽選自乙酸銨或甲酸胺；流動相A中有機酸鹽濃度為0.1mM。


6.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，流動相B中的有機酸鹽選自乙酸銨或甲酸胺；流動相B中有機酸鹽濃度為0.1mM。


7.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～6.50min，流動相B體積百分比維持在23～27％；6.50～6.60min，流動相B體積百分比由23～27％增至58～62％；6.60～8.68min，流動相B體積百分比由58～62％遞增...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王俊霞，劉浩浩，李月杰，劉釜均，
申請(專利權)人：上海藥明奧測醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31