一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法技術

本發明專利技術提供了一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法，采用本發明專利技術的方法檢測尿液中肌氨酸具有較高的準確度，并且特異性強，重現性好，前處理過程無須衍生和氮吹，操作簡單，一般實驗室均可完成，可以進行大批量樣本處理和檢測。

【技術實現步驟摘要】
一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法
本專利技術涉及尿液檢測
，特別涉及一種非診斷目的高效液相色譜串聯質譜檢測尿液中肌氨酸的方法。
技術介紹
前列腺癌是威脅男性健康的常見腫瘤之一，病死率僅次于肺癌，中國的前列腺癌發病率呈明顯上升趨勢，大部分患者以尿路癥狀或骨痛就診，血清前列腺特異性抗原(prostateantigen,PSA)檢測在臨床上廣泛應用于前列腺癌的早期篩查和診斷。臨床上需要對PSA異常患者進行穿刺活檢去的組織病理學診斷后方可確診。PSA是前列腺特異性抗原非前列腺癌特異性抗原，診斷結果存在灰區。PSA在診斷前列腺癌灰區的含量為4-10ng/mL,在此區間不能準去的區分前列腺癌增生、前列腺炎和早期前列腺癌。在中國，PSA含量4-10ng/mL范圍內穿刺活檢前列腺癌陽性率不足20％，且確診需活檢數次，對于患者來說這一過程非常痛苦。此外，活檢穿刺可能會增加腫瘤轉移風險增加感染等并發癥的發生。肌氨酸是一種存在于人體肌肉和其他組織的天然氨基酸，為甘氨酸的代謝產物，前列腺癌患者的尿液中肌氨酸水平顯著高于健康人群，可作為前列腺癌的新型、簡便、無創的生物標志物，臨床檢測數值可用于評判患者前列腺癌患癌的可能性，且對早期前列腺癌的診斷準確性優于PSA。肌氨酸加成呢僅需采集患者清晨中段尿液，增加前列腺癌的檢測準確率，減少血樣采集及活檢穿刺給患者帶來的痛苦。基于我國初診前列腺癌分期偏晚，早期前列腺癌具有隱匿性的特點，且早期前列腺癌存在有效的治療措施，以及國內外研究和文獻報道的支持，在我國開展前列腺癌的檢查具有重大的意義，可提高前列腺的治療效果，改善預后等。目前衍生化高效液相色譜法在臨床肌氨酸的檢測中應用較多，但存在操作繁瑣、影響因素多、分析時間長等缺點，給實際工作帶來了諸多不便。本專利采用液相色譜-質譜聯用法對尿液中的肌氨酸進行檢測，前處理無需衍生，省時省力的同時提高了檢測結果的敏感性。
技術實現思路
本專利技術的目的是解決現有肌氨酸檢測方法的缺陷，提供了一種非診斷目的非衍生化方法檢測尿液中肌氨酸的方法。一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法，包括如下步驟：(1)使用A1試劑和A2試劑對尿液樣品中的肌氨酸進行釋放；(2)使用液相色譜法對釋放后的肌氨酸進行進一步分離；(3)使用質譜法分析釋放的肌氨酸，從而對肌氨酸進行定性和/或定量檢測。色譜條件包括：色譜柱為C18柱，流動相A為甲酸水，流動相B為甲酸甲醇，梯度洗脫。進一步地，色譜柱為PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；流動相A為0.1％的甲酸水，流動相B為0.1％的甲酸甲醇。進一步地，色譜條件還包括：流速為0.3mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為2μL。進一步地，梯度洗脫程序見下表：時間(min)流速(ml/min)A％B％00.395520.3307030.330703.10.39554.00.3955。質譜條件包括：在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式；噴霧電壓為5500V；氣簾氣為32psi；離子源氣流GS1為55psi，GS2為55psi；離子源溫度為500℃；同時監測目標物肌氨酸m/z90.1→44.1；肌氨酸去簇電壓為15V、碰撞電壓6V。所述的A1試劑由甲酸、甲醇按照一定的比例混合而成；所述的A2試劑由甲醇和肌氨酸氘代物按照一定的比例混合而成。進一步地，A1試劑中，甲酸、甲醇按照1：1000體積比進行配比。進一步地，A2試劑中，肌氨酸氘代物的濃度為5ng/mL。進一步地，尿液樣品、A1試劑和A2試劑的體積比為1:2:1。其中，使用A1試劑和A2試劑對尿液樣品中的肌氨酸進行釋放，具體實施過程為：將尿液樣品依次和A1試劑、A2試劑按照一定比例進行混合，室溫渦旋一段時間后即對尿液樣品中的肌氨酸進行釋放。進一步地，上述實施過程為：取尿液50μL于1.5ml離心管中，加100μLA1試劑后再加入50μLA2試劑，渦旋混合5min，12000r/min,4℃離心10min，取上清液用于檢測。進一步地，A2試劑按如下方法得到：精確稱取10.0mg氘代同位素內標品于10mL容量瓶中，加入甲醇使其完全溶解，并用甲醇定容至容量瓶刻度，得到濃度為1.0mg/mL的同位素內標儲備溶液，然后用甲醇將內標儲備溶液稀釋至5ng/mL。定量步驟包括：利用內標法定量，以基質中標準品的濃度為Y軸，基質中標準品與氘代物內標的峰面積比為X軸，建立標準曲線，從而對肌氨酸進行定量檢測；所述基質為0.5％牛血清白蛋白水溶液或尿液。A1試劑的作用：根據肌氨酸的酸堿性質，甲醇中加入一定比例的甲酸，可使90％的肌氨酸以非電離形式存在而更易溶于有機溶劑中。A2試劑的作用：利用肌氨酸和肌氨酸內標的峰面積比值來定量，減小或消除了基質效應，定量更準確。本專利技術的有益效果：采用本專利技術的方法檢測尿液中肌氨酸具有較高的準確度，并且特異性強，重現性好，前處理過程無須衍生和氮吹，操作簡單，一般實驗室均可完成，可以進行大批量樣本處理和檢測，而且節約分析成本，所需分析時間較短，檢測樣本易采集。附圖說明構成本申請的一部分的說明附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，本專利技術的示意性實施例及其說明用于解釋本專利技術，并不構成對本專利技術的不當限定，其中：圖1肌氨酸在尿液樣本中的總離子流色譜圖；圖2肌氨酸在0.5％BSA中的校準曲線；圖3基質替代試驗檢測結果；使用本專利技術中方法，對尿液中的肌氨酸進行檢測，得到相應的高特異性的質譜峰圖。具體實施方式根據下述實施例，可以更好的理解本專利技術。然而本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于本專利技術，而不應該也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術實施例1液相色譜串聯質譜法測定人尿液中肌氨酸取尿液50μL于1.5ml離心管中，加100μLA1試劑后再加入50μLA2試劑，渦旋混合5min，12000r/min，4℃離心10min，取上清150μl用于檢測。檢測即獲得人尿液中肌氨酸的總離子流色譜圖(圖1)。具體的色譜條件如下：(1)流動相A：體積比為0.1％的甲酸水；(2)流動相B：體積比為0.1％的甲酸甲醇，甲醇純度為HPLC級；(3)色譜柱型號：PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；(4)流速為0.3mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為2μL；(5)采用梯度洗脫的方式，見下表；時間(min)流速(ml/min)A％...

【技術保護點】
1.一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)使用A1試劑和A2試劑對尿液樣品中的肌氨酸進行釋放；(2)使用液相色譜法對釋放后的肌氨酸進行進一步分離；(3)使用質譜法分析釋放的肌氨酸，從而對肌氨酸進行定性和/或定量檢測；/n色譜條件包括：色譜柱為C18柱，流動相A為甲酸水，流動相B為甲酸甲醇，梯度洗脫。/n

【技術特征摘要】
1.一種非診斷目的檢測尿液中肌氨酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)使用A1試劑和A2試劑對尿液樣品中的肌氨酸進行釋放；(2)使用液相色譜法對釋放后的肌氨酸進行進一步分離；(3)使用質譜法分析釋放的肌氨酸，從而對肌氨酸進行定性和/或定量檢測；
色譜條件包括：色譜柱為C18柱，流動相A為甲酸水，流動相B為甲酸甲醇，梯度洗脫。


2.根據權利要求1的方法，其特征在于，色譜柱為PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；流動相A為0.1％的甲酸水，流動相B為0.1％的甲酸甲醇。


3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于，色譜條件還包括：流速為0.3mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為2μL。


4.根據權利要求1的方法，其特征在于，梯度洗脫程序如下表：










時間(min)
流速(ml/min)
A％
B％


0
0.3
95
5


2
0.3
30
70


3
0.3
30
70


3.1
0.3
95
5


4.0
0.3
95
5






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...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉翼飛，劉曉紅，何心友，韓婧，張夢娜，
申請(專利權)人：合肥譜佳醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：安徽;34