一種用于缺血性心臟病基因靶向治療的載基因顯影微泡及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于缺血性心臟病基因靶向治療的載基因顯影微泡及其制備方法。所述的載基因顯影微泡包括陽離子顯影微泡以及分散于顯影微泡外殼表面的治療基因質(zhì)粒，其中，所述的顯影微泡具有正電性的脂質(zhì)雙分子層外殼以及包裹在外殼內(nèi)部的生物惰性氣體，所述的治療基因質(zhì)粒包括含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種用于缺血性心臟病基因靶向治療的載基因顯影微泡及其制備方法


[0001]本專利技術(shù)涉及一種用于缺血性心臟病基因靶向治療的載基因顯影微泡及其制備方法。本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥


技術(shù)介紹

[0002]世界范圍內(nèi)每年大概有近2000萬人死于心血管疾病，而這個(gè)數(shù)字至2030年將會(huì)迅速增長至2630萬人
[1
?
2]。隨著生活水平的提高以及生活方式的改變，近40年來，我國缺血性心臟病的發(fā)病率及死亡率亦呈逐年上升態(tài)勢，在所有心臟疾病中居首位。缺血性心臟病可引發(fā)心臟功能細(xì)胞的不可逆性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤、心肌間質(zhì)重構(gòu)等一系列的內(nèi)在變化，最終導(dǎo)致難以控制的心力衰竭甚至死亡
[3
?
4]。目前，國際上針對(duì)缺血性心臟疾病的標(biāo)準(zhǔn)臨床治療手段包括藥物溶栓治療、介入支架及冠脈搭橋手術(shù)等，這些治療方式均以重建缺血區(qū)域的血運(yùn)為主要目的稱為急診冠脈再血管化(CR)，雖然能夠通過恢復(fù)殘存心肌供血、改善心臟功能達(dá)到治療的效果，然而并不能徹底阻止或者逆轉(zhuǎn)缺血對(duì)心臟組織造成的病理損害，所以仍有相當(dāng)一部分患者在治療的近期，尤其是遠(yuǎn)期出現(xiàn)心力衰竭影響患者的生存質(zhì)量，甚至造成死亡。近20年來缺血性心臟病患者的死亡率始終沒有明顯下降
[5
?
8]。因此，如何在恢復(fù)血供的同時(shí)，針對(duì)缺血損傷的病理進(jìn)程及病理損害進(jìn)行精準(zhǔn)的調(diào)控，以有效降低急診CR治療后心衰的發(fā)生率，改善患者的生存質(zhì)量并降低死亡率，是目前心血管病醫(yī)生迫切希望解決的一個(gè)難題。
[0003]缺血性心臟病會(huì)造成心臟功能細(xì)胞的調(diào)亡、炎癥反應(yīng)、心肌間質(zhì)重構(gòu)等一系列病理生理改變，造成心肌纖維化、瘢痕形成等病理損傷，影響心臟的舒縮功能，最終造成心力衰竭甚至死亡
[3
?
4]。而對(duì)缺血心肌給予急診CR治療后，上述的病理改變并不會(huì)完全逆轉(zhuǎn)。有文獻(xiàn)顯示，缺血心肌在急診CR后會(huì)在一定程度上繼續(xù)存在心臟細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤、炎癥因子釋放、基質(zhì)金屬蛋白酶激活和膠原組織增生等現(xiàn)象
[9
?
12]，其中心臟功能細(xì)胞的繼續(xù)喪失會(huì)直接導(dǎo)致心臟功能單位的減少，同時(shí)會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性因子釋放，加重周圍心肌細(xì)胞的進(jìn)一步損傷及間質(zhì)的纖維化；另一方面，炎癥反應(yīng)、基質(zhì)金屬蛋白酶激活和膠原組織增生等會(huì)造成不良心室間質(zhì)重構(gòu)，最終可導(dǎo)致纖維瘢痕形成和心功能下降。而在目前的臨床治療過程中，在急診CR后并沒有針對(duì)上述病理改變進(jìn)行精準(zhǔn)、有效的后續(xù)治療手段，從而導(dǎo)致急診CR治療后近期、尤其是遠(yuǎn)期心衰發(fā)生率高、治療效果差。
[0004]應(yīng)用基因治療以達(dá)到對(duì)缺血性心臟病的精準(zhǔn)治療一直是心血管研究領(lǐng)域力求實(shí)現(xiàn)突破性進(jìn)展的努力方向，其在實(shí)驗(yàn)室階段的治療效果已經(jīng)在大量的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中得到強(qiáng)有力的印證。本專利技術(shù)人既往通過多項(xiàng)研究證實(shí)以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為載體，應(yīng)用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子
?
3(TIMP
?
3)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)等基因?qū)θ毖孕呐K疾病進(jìn)行基因治療能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)缺血組織的相應(yīng)病理改變，改善心臟功能，最終達(dá)到對(duì)缺血性心臟病的有效治療
[13
?
17]。相較于體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的可控性，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染因其在轉(zhuǎn)染效率以及在安全性、有效性、靶向性等多方面存在較多制約
因素而無法有效開展，限制了其臨床的應(yīng)用。
[0005]目前，常規(guī)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方式主要包括將病毒、質(zhì)粒或者攜帶基因的細(xì)胞直接注射到靶器官或直接輸注到血液循環(huán)系統(tǒng)中
[18
?
20]。這些轉(zhuǎn)染方式主要存在以下缺陷：
①
轉(zhuǎn)染途徑受限：將攜帶目的基因的載體直接注射于靶器官內(nèi)，雖可實(shí)現(xiàn)目的基因向靶器官的直接定向傳輸，但往往會(huì)造成組織侵入性的創(chuàng)傷，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性，且可重復(fù)操作性差；而將攜帶目的基因的載體輸注于血液循環(huán)系統(tǒng)中，雖然是一種微創(chuàng)的轉(zhuǎn)染手段，但是由于載體隨血液系統(tǒng)流經(jīng)全身，所以不能準(zhǔn)確定位，且轉(zhuǎn)染效率低下、轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定；
②
基因載體受限：質(zhì)粒載體相對(duì)安全，但是會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被血漿中的DNA酶快速清除而造成轉(zhuǎn)染效率低下，病毒類載體轉(zhuǎn)染率相對(duì)較高但因存在潛在的毒性、致癌、致畸作用等而在安全性方面存在較大問題，而利用轉(zhuǎn)染了目的基因的細(xì)胞移植尤其是干細(xì)胞移植雖然能夠參與受損組織的修復(fù)與再生，但目前干細(xì)胞移植仍存在種子細(xì)胞類型的選擇、細(xì)胞不穩(wěn)定分化、移植細(xì)胞存活率低和臨床應(yīng)用安全性等問題尚未解決。而對(duì)于缺血性心臟病CR后的進(jìn)一步治療，需要針對(duì)缺血損傷的不同病理階段的不同病理損傷有針對(duì)性的應(yīng)用不同的基因進(jìn)行重復(fù)的精準(zhǔn)治療方能達(dá)到最佳的治療效果。這就更需要一種損傷小、操作簡單以便于實(shí)現(xiàn)反復(fù)操作，能夠高效精準(zhǔn)的將目的基因轉(zhuǎn)染靶器官，可以針對(duì)不同的病理階段存在多種劑型的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方式以實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血性心臟病最有效的精準(zhǔn)治療。
[0006]近年來，隨著超聲波靶向微泡擊碎技術(shù)(UTMD)的高速發(fā)展以及其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染時(shí)無需長時(shí)間準(zhǔn)備即能夠達(dá)到無創(chuàng)、靶向、高效轉(zhuǎn)染效果的特性
[21
?
25]為實(shí)現(xiàn)上述治療需求帶來了可能。本專利技術(shù)人前期研究已經(jīng)證實(shí)了應(yīng)用UTMD技術(shù)可將攜帶特定基因的脂質(zhì)微泡擊碎從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)基因的靶向轉(zhuǎn)染，即實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠及小鼠缺血性心臟疾病的無創(chuàng)、靶向基因治療,從而顯著改善心臟功能
[18
?
20，26]。因此，在本申請(qǐng)中我們將SIRT3的抗氧化應(yīng)激損傷的特性、TIMP
?
3的抗間質(zhì)重構(gòu)能力和UTMD的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染優(yōu)勢結(jié)合起來，針對(duì)缺血性心臟損傷的不同病理階段及不同病理損傷，分別制造兩種劑型的基因顯影微泡，應(yīng)用UTMD無創(chuàng)靶向技術(shù)分別在缺血后的不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用特定的頻次，在急診CR后的心肌組織中改變損傷局部SIRT3及TIMP
?
3的表達(dá)含量，提高心肌組織自身的抗氧化應(yīng)激損傷和抗間質(zhì)重構(gòu)的能力，進(jìn)而改善急診CR后的近期及遠(yuǎn)期的治療效果，為進(jìn)一步改善臨床對(duì)缺血性心臟病的治療效果，并提高患者的生存質(zhì)量及生存率探索出一種易于臨床轉(zhuǎn)化、無創(chuàng)、高效、精準(zhǔn)的治療方法。
[0007]參考文獻(xiàn)：
[0008][1]Benjamin EJ,Muntner P,Alonso A,et al.Heart disease and stroke statistics
?
2019update:a report from the American Heart Association.Circulation.2019；139:56
?
66.
[0009][2]O
’
Neill BJ,Rana SN,Bowman V.An integrated approach for vascular health:a call to action.Can J Cardiol.2015；31:99
?
102.
[0010][3]Kang HJ,Kim HS,Zhang SY,本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于缺血性心臟病靶向治療的載基因顯影微泡，其特征在于，所述的載基因顯影微泡包括陽離子顯影微泡以及分散于顯影微泡外殼表面的治療基因質(zhì)粒，其中，所述的顯影微泡具有正電性的脂質(zhì)雙分子層外殼以及包裹在外殼內(nèi)部的生物惰性氣體，所述的治療基因質(zhì)粒包括含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子
?
3(TIMP
?
3)和沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)基因的質(zhì)粒。2.如權(quán)利要求1所述的載基因顯影微泡，其特征在于，所述的生物惰性氣體為C3F8。3.如權(quán)利要求1或2所述的載基因顯影微泡，其特征在于，所述的陽離子顯影微泡通過以下方法制備得到：將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂?；字Ｒ掖及?br/> ?
聚乙二醇2000(DSPE
?
PEG2000)、DC膽固醇(DC
?
Chol)按照質(zhì)量比4
?
6:1
?
3:0.1
?
1的比例進(jìn)行混合，再加入三氯甲烷使其充分溶解；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，去除有機(jī)溶劑形成脂膜；在脂膜中加入甘油與PBS混合液，42℃水浴30min
?
1h，取脂膜和甘油、PBS混懸液加入管形瓶中；冷卻后用C3F8置換管形瓶內(nèi)空氣2次，機(jī)械震蕩，即得高濃度陽離子顯影微泡，經(jīng)60Co伽馬射線輻射或紫外線消毒滅菌，正常放置4℃冰箱保存，
?
20℃冰箱可穩(wěn)定保存1月。4.如權(quán)利要求3所述的載基因顯影微泡...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：田海，孫露，陳巍，黃明莉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：