包含抗體CH3域的異源二聚體及含其的抗體、融合蛋白制造技術

本發明專利技術提供了一種包含抗體CH3結構域的異源二聚體，其中一個CH3結構域CH3A的T366被替換為W，另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M、R或N，L368被替換為R，和Y407被替換為W、F或M。本發明專利技術還提供了一種包含該異源二聚體的抗體和融合蛋白。本發明專利技術的異源二聚體的純度相比于目前已報道的突變體有較大的優勢，且具有較佳的穩定性。純度的提高使其在體內藥效提高、毒性降低等，較佳的穩定性可以確保其在體內穩定的發揮作用。的發揮作用。

【技術實現步驟摘要】
包含抗體CH3域的異源二聚體及含其的抗體、融合蛋白


[0001]本專利技術涉及抗體領域，具體涉及一種包含抗體CH3結構域的異源二聚體及含其的抗體、融合蛋白。

技術介紹

[0002]雙特異性抗體(Bi-Specific Antibody，BsAb)，又稱雙抗，可同時識別和結合兩種不同的抗原或同一種抗原的兩種表位，并激活或阻斷兩種不同的信號通路以發揮其作用。其理論上可以發揮兩種單抗聯合的協同作用，是當下行業最熱門的新藥研發投資方向之一。雙特異性抗體在自然狀態下并不存在，需要通過重組DNA或細胞融合技術人工制備實現，借助DNA重組和蛋白質工程技術手段構建的BsAb也成為抗體藥物新的研究方向之一。早在1960年間就有人用來自兩個不同的多克隆血清的Fab結合成雙特異性F(ab')2。1975年雜交瘤技術的建立推動了雙抗技術的發展，雙抗除了可以通過化學綴合法合成外，還可以通過兩個雜交瘤的融合形式雜合子的雜交瘤而生產雙抗。而重組抗體技術的發展使得雙抗技術飛速發展，幾十種具有不同結構和功能的雙抗被報道。雙特異性抗體越來越受到重視，迄今三種雙特異性抗體Catumaxomab(抗EpCAM
×
抗CD3)、Blinatumomab(抗CD19
×
抗CD3)和Emicizumab(抗Factor IX
×
抗Factor X)已被FDA批準用于臨床治療，其他幾十種雙抗藥物目前正在臨床研發階段。
[0003]人體內的天然抗體是單抗原特異性的，而雙特異性抗體卻能夠識別兩種抗原或同一種抗原的兩種表位。與單抗相比，雙抗有多種優勢：
①“
AB”形式可以解決一些“A+B”形式無法解決的問題，比如T細胞(T cell)募集和殺傷。
②
雙靶點雙抗效果可能優于兩個單靶點單抗的聯合使用。比如HER2雙位點的雙抗，有藥企在臨床前發現HER2雙位點雙抗相對于單抗，可以使得HER2受體在細胞表面形成網狀的連接，形成集聚，提高抑制腫瘤的效果，甚至可能對HER2中低表達的乳腺癌有效，目前正在臨床驗證中，1期臨床已經顯現了部分效果。
③
雙靶點雙抗副作用可能小于兩個單靶點單抗的聯合使用。比如CD47單抗容易結合紅細胞和血小板，造成貧血，CD47-PDL1雙抗或者CD47-CD19雙抗會減小副作用，其潛在機理是另一端(PDL1或CD19結合區)會靶向腫瘤細胞，起到牽引作用，讓CD47抗體部分更多在腫瘤細胞上起作用，從而減少副作用。不過，這類假設目前還有待驗證，相關藥物正在或準備臨床中。另外，PDL1-CTLA4雙抗可能也會有類似效果，其副作用可能小于PD1和CTLA4單抗的聯合使用，CTLA4單獨使用的副作用很大，PDL1-CTLA4雙抗可能會更好的靶向腫瘤細胞，使得副作用減小，目前有實驗正在做II期臨床。
④
在優良設計和成熟平臺基礎上，“AB”雙抗的研發和生產成本應該低于“A+B”兩個單抗的研發和生產成本。
[0004]在雙抗藥物開發的過程中，也面臨很多挑戰，例如如何解決錯配問題、如何改善下游工藝不穩定的問題、如何解決純化問題、如何保證雙抗的穩定性、如何平衡兩個抗體的表達量等，具體包括：
①
雙抗在體內的作用機制比單抗復雜；
②
分子量較大的雙抗，對腫瘤組織的滲透性與單抗相比會相對較差；
③
通常雙特異性抗體在CMC大規模生產階段依賴于親和層析，但大規模的親和層析步驟煩瑣，成本高且產率較低，因此也較難于獲得臨床前和臨
床研究生產足夠質量和數量的材料。
④
雙抗結構比較復雜，全長的雙抗的傳統生產方法是基于抗體重鏈和輕鏈質粒配對共轉染和表達，會導致形成最高達10種不同的由重鏈和輕鏈的各種組合組成的混合物，其中只有一個具有正確的結構，同時生產的過程中多半會伴有較高的多聚體、錯配、純化得率低等問題，如果雙抗純度保證不了，會使其在體內藥效下降、毒性升高等問題；
⑤
雖然已有幾十種具有不同結構和功能的雙抗被報道，但真正好用的結構大都由大公司的專利壁壘保護，旁人不能輕易觸碰。
[0005]為了克服上述挑戰，各種不同結構的雙特異性抗體被開發出來，一般根據是否含有Fc區而被分為IgG-like雙特異性抗體和non-IgG-like雙特異性抗體(如BiTE、DART等)。相對而言，IgG-like雙特異性抗體在產量、純度、體內穩定性、Fc效應介導、免疫原性小等各方面均有優勢，具體包括：
①
其Fc部分有助于抗體后期的protein A親和純化并提高其溶解性、穩定性，在CMC的大規模純化和生產方面有優勢；
②
具有Fc介導的效應功能，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、補體依賴的細胞毒作用(CDC)和抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用(ADCP)；
③
相對分子量較大，且Fc部分與受體FcRn結合，增加了抗體血清半衰期。此類抗體結構主要包括Triomabs/Quadroma、DVD-Ig(dual variable domain Ig)、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv
2-Fc。目前全球共批準了3款雙特異性抗體藥物，只有安進的Blincyto屬于non-IgG-like雙特異性抗體，其他兩款皆屬于IgG-like雙特異性抗體。
[0006]但IgG-like的雙抗生產過程中重輕鏈錯配的問題至今仍無法徹底解決。目前來說，解決重鏈錯配的問題的方法有旋鈕入孔法(Knobs-into-holes，KIH)、靜電轉向突變(Electrostatic Steering Mutations)、人類IgG4 Fab臂交換(Fab Arm Exchange of human IgG4 isotype)、SEEM法、不同亞型的重鏈配對法()、單臂抗體(One-Armed Antibodies)等。旋鈕入孔法(Knobs-into-holes，KIH)最早是在1996年被Ridgway報道的(John B.B.Ridgway.et al.'Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Engineering.vol.9no.7pp.617-621.1996)，在這項研究中，“旋鈕”端是通過定點突變A鏈CH3段T366位氨基酸成Y，并將B鏈CH3段的Y407突變成T，因此形成旋鈕-孔的嵌入式結構。抗CD3/CD4-IgG(T366Y/Y407
’
T，第1代)雜合體在蛋白A純化后最高能得到92％純度的蛋白，而野生型的抗CD3/CD4-IgG雜合體最高只占回比率的57％。1997年，Atwell利用噬菌體展示技術篩選位于A和B鏈CH3界面上相互作用的殘基，找到能穩定A:B雜合體的突變組合(Shane Atwell.et al.Stable Heterodimers 本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種包含抗體CH3結構域的異源二聚體，其中，一個CH3結構域CH3A的T366被替換為W，其特征在于，另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M、R或N，L368被替換為R，和Y407被替換為W、F或M，所述氨基酸位置根據EU系統編號；較佳地，所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M或N，和/或，所述Y407被替換為W或M。2.如權利要求1所述的異源二聚體，其特征在于，所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M，L368被替換為R，和Y407被替換為W；所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M，L368被替換為R，和Y407被替換為F；所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為R，L368被替換為R，和Y407被替換為W；所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為M，L368被替換為R，和Y407被替換為M；或所述另一個CH3結構域CH3B的T366被替換為N，L368被替換為R，和Y407被替換為W。3.如權利要求1或2所述的異源二聚體，其特征在于，所述抗體CH3結構域為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白的CH3結構域；所述IgG優選為人IgG；所述人IgG優選為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4；和/或，所述CH3結構域CH3A和/或所述CH3結構域CH3B上還包括其他氨基酸的突變，所述突變優選為使得所述CH3結構域CH3A與所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊達志，謝珍慧，郁凱，徐艷玲，萬婷婷，韓照中，
申請(專利權)人：上海睿智化學研究有限公司，
類型：發明
國別省市：