一種純化蛋白質的方法技術

本發明專利技術一般涉及純化蛋白質的方法。更特別地，本發明專利技術涉及從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結合蛋白的方法，及其用途。

【技術實現步驟摘要】
一種純化蛋白質的方法本申請是中國專利申請號201380051960.4(PCT/US2013/062916)，申請日2013年10月01日，專利技術名稱為“一種純化蛋白質的方法”的分案申請。
本專利技術一般涉及一種純化蛋白質的方法。更特別地，本專利技術涉及一種從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結合蛋白的方法，及其用途。
技術介紹
溶血的特征在于紅細胞破壞，并且是與紅細胞異常相關的貧血病癥的性質標志(hall-mark)，比如酶缺陷、血紅蛋白病、遺傳性球形紅細胞增多癥、陣發性夜間血紅蛋白尿癥和棘突紅細胞(spurcell)貧血，以及外源因素比如脾腫大、自身免疫性病癥(例如，新生兒溶血病)、遺傳性疾病(例如，鐮狀細胞病或G6PD缺失癥)、微血管病性溶血、革蘭氏陽性細菌感染(例如，鏈球菌、腸道球菌和葡萄球菌)、寄生蟲感染(例如，瘧原蟲)、毒素和創傷(例如燒傷)。溶血也是一種常見的輸血病癥，特別是大量輸血和在使用體外心肺維持的患者中。患有與溶血相關病癥的患者中可見的副作用主要歸因于從紅細胞釋放鐵和含鐵化合物，比如血紅蛋白(Hb)和血紅素。在生理條件下，釋放的血紅蛋白被可溶性蛋白質比如觸珠蛋白結合，并轉運到巨噬細胞和肝細胞。然而，當溶血發生率加快且事實上變成病理性時，觸珠蛋白的緩沖能力被壓倒。因此，血紅蛋白被快速氧化成鐵血紅蛋白，其依次釋放游離血紅素(包含原卟啉IX和鐵)。雖然血紅素在一些生物進程中起決定作用(例如，作為必需蛋白質比如血紅蛋白和肌紅蛋白的一部分)，但是游離血紅素是高毒性的。游離血紅素是氧化還原活性鐵的來源，其產生損害類脂膜、蛋白質和核苷酸的高毒性活性氧種類(ROS)。血紅素的毒性由于其插入類脂膜的能力而進一步加劇，在類脂膜中血紅素引起膜組分氧化且促進細胞溶解和死亡。在生理學穩態條件下和在輕度溶血期間，連續低水平細胞外Hb/血紅素暴露的進化壓力導致控制游離Hb/血紅素副作用的補償機制。這些系統包括釋放一組結合Hb或血紅素的血漿蛋白，包括Hb清除劑觸珠蛋白(Hp)和血紅素清除劑蛋白質血紅素結合蛋白(Hx)和α-1微小球蛋白。然而，雖然在生理學穩態條件下，內源性Hp和Hx控制游離Hb/血紅素的副作用，但是它們在病理生理學條件(比如與溶血相關的那些條件)下保持穩態Hb/血紅素水平的功效很小。本專利技術提供一種從同一起始原料純化Hp和Hx的方法。所述純化的蛋白質可用于治療與溶血和Hb/血紅素水平異常相關的病癥的組合物中。專利技術簡述在本專利技術的一個方面，提供一種從含有觸珠蛋白和血紅素結合蛋白兩種蛋白質的溶液中純化這兩種蛋白質的方法，所述方法包括：(i)提供含有觸珠蛋白和血紅素結合蛋白兩者的溶液；(ii)通過向溶液中加入硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白；(iii)從含有血紅素結合蛋白的溶液中分離沉淀的觸珠蛋白；和(iv)以一個或多個步驟分別純化觸珠蛋白和/或血紅素結合蛋白。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的觸珠蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的血紅素結合蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的轉鐵蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的觸珠蛋白和通過本文公開的方法回收的血紅素結合蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少95％的觸珠蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80％的血紅素結合蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80％的組合的血紅素結合蛋白和觸珠蛋白的組合物。在本專利技術的另一個方面，提供一種包含如本文公開的本專利技術的組合物和可藥用載體的制劑。在本專利技術的另一個方面，提供一種治療與溶血相關的病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用如本文公開的本專利技術的組合物或制劑。在本專利技術的另一個方面，提供如本文公開的本專利技術的組合物或制劑在制備用于治療與溶血相關的病癥的藥物中的用途。附圖簡述圖1為Cohn分級過程的流程圖。本領域技術人員應當認識到改變圖1中描述的過程參數(例如，pH、乙醇濃度、溫度等)也可以應用于產生Cohn級分。圖2顯示在2.0M、2.5M、3.0M、3.5M和4.0M硫酸銨的存在下沉淀之后，剩余濾液中轉鐵蛋白(TRF)、白蛋白(Alb)、血紅素結合蛋白(HPX)和觸珠蛋白(HAP)的回收。圖3顯示實驗設計(DOE)的需要性圖，顯示從血漿級分中沉淀觸珠蛋白而使血紅素結合蛋白保留在溶液中所期望的條件。DOE是一組用于評價pH和硫酸銨濃度對從觸珠蛋白分離血紅素結合蛋白的能力的影響的控制實驗。使用因子數學設計來設計和分析數據。圖3中描繪的需要性圖使用該數學設計來決定應當產生血紅素結合蛋白和觸珠蛋白兩者的最佳分離和回收的最期望條件。圖4顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后回收的血紅素結合蛋白的SDS-PAGE電泳。使用預制的10％Tris-甘氨酸凝膠(Novex,EC6075)進行SDS-PAGE分析。將所有樣品都在Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(LC2676)中稀釋成0.1mg/mL的濃度，并且將20μL的每種樣品裝入凝膠的樣品孔中。運行時間和電壓設置為凝膠制造商的建議值(恒定125V)。用易于使用類型的考馬斯亮藍染色溶液(Novex,SimplyBlueSafestain,LC6065)對每個凝膠染色。泳道1(LMWS)含有Novex靈敏未染色標準品(NovexSharpUnstainedProteinStandards),LC5801。圖5顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后回收的觸珠蛋白中間體的SDS-PAGE電泳(使用圖4中上述的方法)。泳道2中的觸珠蛋白標準品來自Benesis(T043HPX)。圖6顯示CaptoQ洗脫液在10％Tris-甘氨酸未還原SDS-PAGE電泳凝膠(使用圖4中描述的方法)上的蛋白質印跡。然后，將單獨的蛋白質轉移到硝基纖維素膜，并阻斷該膜防止任何非特異性抗體結合。然后，用含有人觸珠蛋白抗體(兔子抗-人觸珠蛋白SigmaH8636)的溶液培養硝基纖維素膜。然后，用硝基纖維素膜(山羊抗-兔子HRP，SigmaA6154)培養與辣根過氧化酶(HRP)連接的二級抗體。接著，用含有過氧化物的溶液展開硝基纖維素，由此僅顯影特別地含有人觸珠蛋白的蛋白質帶。泳道含有不同濃度的CaptoQImpResEluate(T0209001)(泳道2-1:10稀釋，0.1mg/mL，20μL負載；泳道3-1:20；泳道4-1:40；泳道5-1:80；泳道6-1:160；泳道7-1:320；泳道8-1:640；泳道9-1:1280；和泳道10-1:2560)。蛋白質印跡表明CaptoQEluate中存在大部分條帶是觸珠蛋白。圖7顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后從離子交換層析(CaptoDEAE)回收的轉鐵蛋白的SDS-PAGE電泳(使用圖4本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種藥物組合物，包含血紅素結合蛋白,其中所述組合物進一步包含:/na)約1.6％或更低的觸珠蛋白；和/nb)約0.2％或更低的白蛋白,/n其中所述觸珠蛋白和白蛋白的百分比是基于總蛋白重量的重量百分比。/n

【技術特征摘要】
20130411 AU 2013203930;20130603 EP 13170202.9;20121.一種藥物組合物，包含血紅素結合蛋白,其中所述組合物進一步包含:
a)約1.6％或更低的觸珠蛋白；和
b)約0.2％或更低的白蛋白,
其中所述觸珠蛋白和白蛋白的百分比是基于總蛋白重量的重量百分比。


2.權利要求1的藥物組合物，其中所述觸珠蛋白和白蛋白通過濁度法檢測。


3.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物進一步包含:
a)0.3％或更低的轉鐵蛋白，并且
其中所述轉鐵蛋白的百分比是基于總蛋白重量的重量百分比。


4.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物進一步包含約0.1％的α-2巨球蛋白。


5.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物經巴氏滅菌和/或經歷降低病毒程序。


6.權利要求5的藥物組合物，其中所述降低病毒程序為溶劑/洗滌劑處理和/或納米過濾。


7.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物包含含量為總蛋白的至少95％的血紅素結合蛋白。


8.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物包含含量為總蛋白的至少97％的血紅素結合蛋白。


9.權利要求1的藥物組合物，其中所述組合物包含含量為總蛋白的至少98％的血紅素結合蛋白。

【專利技術屬性】
技術研發人員：N·布林克曼，
申請(專利權)人：瑞士杰特貝林生物制品有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH