一種定法端粒酶的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種定法端粒酶的制備方法，涉及酶的提取技術(shù)領(lǐng)域，為解決現(xiàn)有技術(shù)中，端粒酶提取方法存在的提取效率低的技術(shù)問題，本發(fā)明專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：包括如下步驟：步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶；步驟S2，對步驟S1中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的LPTS蛋白或其活性片段。LPTS蛋白或其活性片段。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種定法端粒酶的制備方法


[0001]本專利技術(shù)涉及酶的提取
，尤其涉及一種定法端粒酶的制備方法。

技術(shù)介紹

[0002]端粒是存在于真核細胞線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽狀”結(jié)構(gòu)，維持染色體的完整和細胞活性，其實質(zhì)為一小段DNA-蛋白質(zhì)復合體。端粒與有絲分裂有著密切的聯(lián)系，細胞每分裂一次，端粒就縮短30～200bp，當縮短到2～4kb，會導致細胞復制功能衰退，引起細胞衰老或死亡，被科學家稱為“有絲分裂時鐘”和“生命時鐘”。
[0003]端粒的延長和重組機制都是通過端粒酶來催化和介導的，端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞活性和潛在的增殖能力等方面發(fā)揮重要作用。端粒酶活性的高低將會影響端粒長度的變化，繼而影響到細胞的壽命。在衰老的細胞中，端粒梅的數(shù)量及活性下降，如何提高衰老細胞中端粒酶的數(shù)量或活性，對于延長細胞壽命、延緩機體衰老具有重大意義。
[0004]傳統(tǒng)的端粒酶提取方法采用超聲等物理破碎的方法，在造血干細胞及癌細胞中進行提取，但是提取效率并不高，無法滿足大規(guī)模醫(yī)藥品的加工需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0005]為解決現(xiàn)有技術(shù)中，端粒酶提取方法存在的提取效率低的技術(shù)問題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：
[0006]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0007]步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶；
[0008]步驟S2，對步驟S1中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的 LPTS蛋白或其活性片段。
[0009]進一步，步驟S1中使用的陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose。
[0010]進一步，步驟S1中的條件是，陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8
?±
0.2，30
±
5mmol/L的KH2PO
4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5
±
0.05mol/L NaCl溶液段的洗脫峰作為初提純液。
[0011]進一步，步驟S2中所用的葡聚糖凝膠是Sephadex G100。
[0012]進一步，步驟S2中的條件是，葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30
±?
10mmol/L NH4HCO3為平衡液和洗脫液，收集主洗脫峰，用SDS-PAGE電泳驗證，即為純化的LPTS蛋白或其活性片段。
[0013]進一步，在步驟S1和S2之間還包括步驟：將步驟S1中的初提純液的體積濃縮至初提純液原體積的1/3-1/50。
[0014]進一步，所述的純化的LPTS蛋白的純度大于80％，其活性片段的純度大于90％。
[0015]進一步，所述的活性片段是具有至少80％全長LPTS的端粒酶的活性片段，較佳地選自下組：LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；6His與LPTS的 C末端的197個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
[0016]進一步，其中端粒酶是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段選自下組：LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；6His與LPTS的C末端的197 個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
[0017]進一步，所述端粒酶是具有SEQ ID NO：5或6所示氨基酸序列的多肽。
[0018]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
[0019]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，可以從成分較為復雜的LPTS蛋白培養(yǎng)液或腫瘤中提取端粒酶，提取過程簡單高效，工藝流程短且成本較低，相比較傳統(tǒng)的超聲等物理破碎的方法，本專利技術(shù)可有效保證端粒酶的活性，提取率也高于傳統(tǒng)方式，在醫(yī)藥品工業(yè)中具有較高的推廣價值。
具體實施方式
[0020]下面對本專利技術(shù)的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。基于本專利技術(shù)中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術(shù)保護的范圍。
[0021]實施例1
[0022]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，包括如下步驟：
[0023]步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶。陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8
±
0.2， 30
±
5mmol/L的KH2PO
4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5
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0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脫峰作為初提純液。
[0024]步驟S2，對步驟S1中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30
±
10mmol/L NH4HCO3為平衡液和洗脫液，收集主洗脫峰，用SDS-PAGE電泳驗證，即為純化的LPTS蛋白或其活性片段。
[0025]實施例2
[0026]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，包括如下步驟：
[0027]步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶。陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8
±
0.2， 30
±
5mmol/L的KH2PO
4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5
±
0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脫峰作為初提純液。
[0028]將步驟S1中的初提純液的體積濃縮至初提純液原體積的1/3。
[0029]步驟S2，對步驟S1中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30
±
10mmol/L NH4HCO3為平衡液和洗脫液，收集主洗脫峰，用SDS-PAGE電泳驗證，即為純化的LPTS蛋白或其活性片段。其中，純化的LPTS蛋白的純度大于80％，其活性片段的純度大于90％。
[0030]實施例3
[0031]本專利技術(shù)中的一種定法端粒酶的制備方法，包括如下步驟：
[0032]步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶。陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8
±
0.2， 30
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5mmol/L的KH2PO
4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5
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0.05mol/L NaCl 溶液段的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟S1，對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶；步驟S2，對步驟S1中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的LPTS蛋白或其活性片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，步驟S1中使用的陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，步驟S1中的條件是，陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8
±
0.2，30
±
5mmol/L的KH2PO
4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5
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0.05mol/LNaCl溶液段的洗脫峰作為初提純液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，步驟S2中所用的葡聚糖凝膠是Sephadex G100。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定法端粒酶的制備方法，其特征在于，步驟S2中的條件是，葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30<...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王之洞，
申請(專利權(quán))人：陜西光子動力航天科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：