腺相關(guān)病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞系制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及腺相關(guān)病毒(AAV)載體生產(chǎn)細(xì)胞，其包含編碼以下的核酸序列：AAV rep和cap基因，輔助病毒基因，和所述AAV載體的DNA基因組；所述AAV rep基因包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子包含轉(zhuǎn)錄終止序列，所述轉(zhuǎn)錄終止序列具有位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列上游的第一重組位點和位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列下游的第二重組位點；且所述核酸序列全部一起整合在所述AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞基因組內(nèi)的單一基因座處。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及用于產(chǎn)生AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系的方法。AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系的方法。AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系的方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】腺相關(guān)病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞系
專利

[0001]本專利技術(shù)涉及AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系、用于產(chǎn)生其的方法以及用于所述方法中的核酸載體。
[0002]專利技術(shù)背景腺相關(guān)病毒(AAV)在1965年被發(fā)現(xiàn)，作為腺病毒制備物的污染物。AAV具有近似4.7千堿基(kb)的線性單鏈DNA(ssDNA)基因組，其在末端具有兩個145核苷酸長的反向末端重復(fù)(ITR)。ITR側(cè)接兩個開放閱讀框(rep和cap基因)，其編碼一系列Rep(復(fù)制)和Cap(衣殼)多肽。Rep多肽(Rep78、Rep68、Rep62和Rep40)是非結(jié)構(gòu)蛋白，其參與AAV基因組的復(fù)制、拯救和整合。Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)是結(jié)構(gòu)蛋白，其形成病毒粒子衣殼。AAV已經(jīng)被歸類為依賴細(xì)小病毒屬(細(xì)小病毒科的屬)，因為其需要與輔助病毒(諸如腺病毒、單純皰疹病毒(HSV)或牛痘病毒)共同感染用于在細(xì)胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)性感染。例如，所述腺病毒提供了需要表達(dá)用于AAV復(fù)制和病毒粒子生產(chǎn)的基因：E1A、E1B、E2A、E4和VA (Atchison等人(1965) Science 149:754; Buller等人(1981) J. Virol. 40:241)。
[0003]AAV載體已經(jīng)證明轉(zhuǎn)導(dǎo)和長期基因表達(dá)，并且具有感染分裂中細(xì)胞和靜止細(xì)胞兩者的能力。此外，目前不知道AAV引起疾病，且因此在體內(nèi)幾乎不引起毒性和炎癥。這些特性已導(dǎo)致AAV成為基因療法應(yīng)用的期望載體。
[0004]通常使用幾種在細(xì)胞系中生產(chǎn)AAV載體的方法，并且所述方法可以分為兩種不同的策略。第一種策略基于無野生型輔助病毒的瞬時共轉(zhuǎn)染所有元件(表達(dá)AAV載體DNA(由AAV ITR側(cè)接的轉(zhuǎn)基因)的質(zhì)粒，表達(dá)rep和cap基因的質(zhì)粒，表達(dá)輔助病毒基因的質(zhì)粒，其通常分離自腺病毒)，這是在宿主細(xì)胞(諸如HEK293細(xì)胞)中產(chǎn)生AAV載體所需的(Xia等人(1996) J. Virol. 70:8098)。盡管瞬時共轉(zhuǎn)染方法生成高滴度的無腺病毒的AAV載體，但該過程非常費力，昂貴且難以按比例放大用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]第二種策略涉及細(xì)胞系的野生型輔助病毒(例如野生型腺病毒)感染，所述細(xì)胞系穩(wěn)定地攜帶rep和cap基因，以及由AAV ITR側(cè)接的轉(zhuǎn)基因。盡管所述野生型腺病毒誘導(dǎo)方法可以在培養(yǎng)物中按比例放大并且以高滴度產(chǎn)生AAV載體，但從AAV產(chǎn)物完全除去腺病毒是非常有挑戰(zhàn)性的。鑒于載體安全性和特異性，非常不期望野生型腺病毒的污染。
[0006]當(dāng)前的AAV載體生產(chǎn)方法的缺點可以通過提供穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系用于大規(guī)模臨床級生產(chǎn)重組AAV載體用于臨床用途來克服。然而，由于Rep蛋白對宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗增殖作用可以嚴(yán)重限制其作為AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系的有用性，因此產(chǎn)生組成型表達(dá)rep和cap基因的細(xì)胞系是困難的。例如，已經(jīng)顯示Rep78誘導(dǎo)不依賴于p53的凋亡，這部分歸因于Rep78的DNA結(jié)合和ATPase
?
解旋酶活性。此外，已知Rep78抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，特別是包括S期內(nèi)的完全停滯。Rep78與Rep68一起還在細(xì)胞染色質(zhì)中產(chǎn)生切口，誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答，導(dǎo)致G1和G2阻滯。另外，已經(jīng)顯示Rep78影響cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和發(fā)育中發(fā)揮中心作用(Schmidt等人(2000) J. Virol. 74:9441; Berthet等人(2005) PNAS 102:13634; Schmidt等人(2002) J. Virol. 76:1033)。
[0007]因此，組成型表達(dá)Rep蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系不能存活以達(dá)到在大規(guī)模生物反應(yīng)器中
產(chǎn)生AAV載體所需的細(xì)胞密度。因此，期望具有一種穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系以克服與現(xiàn)有方法和細(xì)胞系相關(guān)的一個或多個缺點，所述生產(chǎn)細(xì)胞系在其基因組中穩(wěn)定地整合可誘導(dǎo)產(chǎn)生重組AAV載體所需的所有遺傳元件和控制系統(tǒng)。
[0008]專利技術(shù)概述本專利技術(shù)人已經(jīng)開發(fā)了新型的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系，其中將編碼重組AAV生產(chǎn)所必不可少的病毒基因(AAV和輔助病毒)和轉(zhuǎn)基因的所有核酸序列在AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞基因組內(nèi)的單個基因座處整合在一起，并且其中Rep蛋白的表達(dá)可以被調(diào)節(jié)以允許有效操縱生產(chǎn)細(xì)胞系，例如在細(xì)胞系生成、細(xì)胞建庫和細(xì)胞擴(kuò)增期間。通過使用表達(dá)控制系統(tǒng)來控制Rep的表達(dá)，其中來自兩種rep啟動子P5和P19的所有rep轉(zhuǎn)錄物都被過早終止，直至期望Rep表達(dá)的時間點。該系統(tǒng)的優(yōu)點是可維持rep和cap基因的所有天然啟動子，以維持有效產(chǎn)生AAV載體所需的各種rep和cap基因轉(zhuǎn)錄物的正確化學(xué)計量。此外，由于表達(dá)控制系統(tǒng)包含在rep基因內(nèi)的內(nèi)含子中(其在RNA加工期間被剪接出)，因此它還具有額外的優(yōu)點：rep和cap基因的mRNA完整性不受影響。
[0009]為了產(chǎn)生本專利技術(shù)的新型AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞系，本專利技術(shù)人已開發(fā)了制備生產(chǎn)細(xì)胞系的新方式，其涉及使用包含非哺乳動物復(fù)制起點且能夠容納至少25千堿基(kb)DNA的核酸載體，諸如細(xì)菌人工染色體，其攜帶對于重組AAV載體生產(chǎn)必不可少的腺相關(guān)病毒(AAV)和輔助基因以及轉(zhuǎn)基因。
[0010]包含非哺乳動物復(fù)制起點且能夠容納至少25kb DNA(即，大型構(gòu)建體DNA)的核酸載體的使用具有幾個優(yōu)點。首先，可以首先在非哺乳動物細(xì)胞(例如，微生物細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞)而不是哺乳動物宿主細(xì)胞中操縱載體，使得它們更易于用以發(fā)揮作用(例如，可以首先在大腸桿菌中操縱細(xì)菌人工染色體)。一旦已制備核酸載體，就可以將其引入哺乳動物宿主細(xì)胞中，并且可以選擇其中核酸載體已整合至內(nèi)源染色體中的一個或幾個中的任何細(xì)胞以分離穩(wěn)定的細(xì)胞系。
[0011]將核酸載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞也可以在單個步驟中發(fā)生，有助于減少選擇壓力和沉默時間范圍。這允許更快速篩選潛在的生產(chǎn)細(xì)胞并降低材料成本，因為與涉及篩選多種質(zhì)粒載體中的每一種的先前方法相比，僅使用了單一載體。具體而言，該系統(tǒng)的使用減少質(zhì)粒制造的成本，降低轉(zhuǎn)染試劑(例如聚乙烯亞胺(PEI])的需求，減少所需的Benzonase
TM
處理量(在病毒收獲物中DNA的量減少，因此需要較少的Benzonase
TM
以在下游處理中除去過量物)并降低測試成本(不需要測試病毒產(chǎn)物中的殘留質(zhì)粒)。這些優(yōu)點與必須遵守GMP要求的用于治療應(yīng)用的重組AAV載體的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)特別相關(guān)。
[0012]此外，因為將編碼重組AAV載體產(chǎn)生必不可少的所有元件的所有核酸序列連續(xù)克隆在同一核酸載體內(nèi)，所以當(dāng)將該載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞時，載體中并入的所有基因?qū)⒄显趦?nèi)源哺乳動物宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的一個基因座處。這使得更容易選擇穩(wěn)定的克隆，其中AAV生產(chǎn)所需的基因無一已經(jīng)整合至可引起基因沉默的基因組區(qū)域中。當(dāng)在幾種質(zhì)粒上提供AAV載體產(chǎn)生所需的基因(其可以在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的不同基因座處隨機(jī)整合)時，對于一種或多種基因可能發(fā)生這種情況。
[0013]因此，本專利技術(shù)提供了一種AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其簡單且針對用于治療應(yīng)用的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化，并且克服了與現(xiàn)有細(xì)胞系相關(guān)的缺點。此外，本專利技術(shù)提供了用于產(chǎn)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.腺相關(guān)病毒(AAV)載體生產(chǎn)細(xì)胞，其包含編碼以下的核酸序列：AAV rep和cap基因，輔助病毒基因，和所述AAV載體的DNA基因組；其中所述AAV rep基因包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子包含轉(zhuǎn)錄終止序列，所述轉(zhuǎn)錄終止序列具有位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列上游的第一重組位點和位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列下游的第二重組位點；且其中所述核酸序列全部一起整合在所述AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞基因組內(nèi)的單一基因座處。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述內(nèi)含子進(jìn)一步包含所述重組位點之間的基因，任選地其中所述基因是可選擇標(biāo)記基因，進(jìn)一步任選地其中所述可選擇標(biāo)記是潮霉素。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼重組酶基因的核酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述編碼重組酶基因的核酸序列與編碼AAV rep和cap基因、輔助病毒基因和AAV載體的DNA基因組的核酸序列一起整合在所述AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞基因組內(nèi)的單一基因座處。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其進(jìn)一步包含重組酶控制系統(tǒng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述重組酶控制系統(tǒng)包含在誘導(dǎo)型啟動子的控制下的重組酶基因和/或與所述重組酶可操作連接的類固醇激素受體配體
?
結(jié)合結(jié)構(gòu)域。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述類固醇激素受體配體
?
結(jié)合結(jié)構(gòu)域是雌激素受體配體結(jié)合
?
結(jié)構(gòu)域(ER)，任選地其中所述ER是ERT2。8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述重組位點是LoxP位點，且所述重組酶基因是cre重組酶基因，任選地其中所述cre重組酶基因是密碼子優(yōu)化的cre重組酶基因(icre)。9.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述重組位點是轉(zhuǎn)座子ITR，且所述重組酶基因是轉(zhuǎn)座酶基因，任選地其中所述轉(zhuǎn)座酶基因是密碼子優(yōu)化的轉(zhuǎn)座酶基因。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)座子ITR和轉(zhuǎn)座酶基因是真核的。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)座子ITR和轉(zhuǎn)座酶源自粉紋夜蛾(T. ni)、Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna)、Bactrocera minuta、Eumeta japonica或棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)。12.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述輔助病毒基因中的一種或多種在轉(zhuǎn)錄控制下。13.根據(jù)權(quán)利要求6或12所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型啟動子或轉(zhuǎn)錄控制分別包含pCMV
?
TO2啟動子。14.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其進(jìn)一步包含絕緣子，任選地其中所述絕緣子存在于所述核酸序列各自之間。
15.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的AAV載體生產(chǎn)細(xì)胞，其進(jìn)一步包含可選擇標(biāo)記，任選地其中所述可選擇標(biāo)記是可擴(kuò)增選擇標(biāo)記。16.包含非哺乳動物復(fù)制起點且能夠容納至少25千堿基(kb)的DNA的核酸載體，其特征在于所述核酸載體包含編碼以下的核酸序列：AAV rep和cap基因；輔助病毒基因；和AAV載體的DNA基因組；其中所述rep基因包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子包含轉(zhuǎn)錄終止序列，所述轉(zhuǎn)錄終止序列具有位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列上游的第一重組位點和位于所述轉(zhuǎn)錄終止序列下游的第二重組位點；且其中編碼AAV rep和cap基因、每種輔助病毒基因和AAV載體的DNA基因組...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：S，
申請(專利權(quán))人：葛蘭素史克知識產(chǎn)權(quán)開發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：