一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法技術

本發明專利技術公開了一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，包括：A.準備工作；B.腦出血模型建立；C.生物模型評價；D.實驗動物分組和檢驗；本發明專利技術根據前期的選篩和培育，減少實驗流程中針對腦出血生物建模的影響，同時能夠篩選受到腦出血遺傳基因影響的大鼠，可直接跳過人為建模，進一步降低實驗流程步驟，同時分別從蛋白和RNA水平，全面而深入的分析了PI3K/AKT/mTOR信號通路和自噬關鍵蛋白LC3?B、BECN1的表達變化，能夠針對生物腦出血具有更為詳細的最終評價。

【技術實現步驟摘要】
一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法
本專利技術涉及一種，特別涉及一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法。
技術介紹
腦出血作為腦卒中的一個亞型，是指非外傷性腦實質出血，具有發病率和死亡率高、預后差、并發癥多等特點，對人體的危害僅次于惡性腫瘤和心臟疾病，是人類致死和致殘的重要原因之一。腦出血后的病理損傷主要包括物理性損傷和血腫的占位效應等引起的原發性腦損傷，以及血液循環障礙、代謝紊亂、腦水腫、炎癥反應和神經細胞死亡等繼發性腦損傷，。而現有的腦出血生物建模方式一般為膠原酶注入法、自體血局部注入法和高血壓基因動物培育，均具有出血量不可控、出血區域不可控和自然性模擬受外力影響等問題，同時在后續所形成的評價方式不夠準確，對照實驗中組別較多和對照實驗的結論難以確認等現象。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法。為了解決上述技術問題，本專利技術提供了如下的技術方案：本專利技術一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，具體包括如下步驟：A.準備工作；選取SPF級大鼠，月齡均為3-9個月，體重為250-500g，按照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠右側尾殼核部位，對大鼠顱頂目標區域脫毛，將麻醉后備皮的大鼠固定于立體定位儀上；B.腦出血模型建立；采用超聲造影劑對目標大鼠靜脈注射，并結合超聲設備，利用超聲探頭于大鼠顱頂目標區域覆蓋，利用超聲造影劑形成血腦屏障開放，血液由血管內部向腦實質滲出；C.生物模型評價；針對蘇醒后的大鼠，按照其動作和行為評分，同時采用CT血管造影成像詳細檢查出血區域；D.實驗動物分組和檢驗；將實驗動物按照模型對照組、實驗組、3-MA抑制劑組和3-MA抑制劑式實驗組分類，實驗完成后即采用神經行為觀測、染色檢測和腦組織檢測法，驗證最終實驗結果。作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟C中，大鼠造模后平均蘇醒時間約為2小時，后將大鼠放置于無蓋木質空箱子內，觀察其前爪形態及行走步態等體征，針對動作和行為的評分標準如下：(1)大鼠與造模前并無異樣，可正常自由行走，即為無神經功能缺損，計0分；(2)大鼠病灶對側前爪于行走或靜態時不能完全伸展，計1分；(3)大鼠行走時向病灶對側轉圈或行走軌跡呈弧線狀，計2分；(4)大鼠行走時肢體向病灶對側傾斜或傾倒，計3分；(5)大鼠蘇醒后，有肢體活動但不能自發行走或有意識喪失等癥狀，計4分；上述評分標準中＞0者判定為出現神經功能缺損體征，在步驟D中處死后取腦證實顱內血腫者視為造模成功，否則棄之不用，在同批大鼠中隨機抽樣重新入組。作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟D中的檢驗方法具體包括如下步驟：神經行為學觀察方法中，主要應用Berderson評分法，同時參考Longa肢體對稱實驗評分法；染色檢測法主要為HE染色檢測腦組織病變法；腦組織檢測法中包含有ELISA檢測腦組織和Westernblot法檢測腦組織。作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟A中，大鼠需于實驗前1周內飼養觀察健康狀態，具有遺傳性腦出血的大鼠篩出并跳過步驟B，具有影響神經類疾病的大鼠篩出棄用。作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟B中，需保持目標大鼠的體溫維持至35-36度，靜脈注射區域為大鼠尾部，同時在注射后10-15s后將其尾部置于45-50度水中浸泡。與現有技術相比，本專利技術的有益效果如下：1：本專利技術通過采用超聲造影方式，減少后續評價和檢驗流程中的組別對照，并且設置相應的環境溫度和水溫影響大鼠的體液代謝速度，增加超聲造影生物模型制作效率。2：本專利技術根據前期的選篩和培育，減少實驗流程中針對腦出血生物建模的影響，同時能夠篩選受到腦出血遺傳基因影響的大鼠，可直接跳過人為建模，進一步降低實驗流程步驟。3：本專利技術運用免疫印跡分析和WB技術，分別從蛋白和RNA水平，全面而深入的分析了PI3K/AKT/mTOR信號通路和自噬關鍵蛋白LC3-B、BECN1的表達變化，能夠針對生物腦出血具有更為詳細的最終評價。附圖說明附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本專利技術的實施例一起用于解釋本專利技術，并不構成對本專利技術的限制。在附圖中：圖1是本專利技術的評價流程示意圖；具體實施方式以下本專利技術的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。實施例1本專利技術提供一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，具體包括如下步驟：A.準備工作；選取SPF級大鼠，月齡均為3-9個月，體重為250-500g，按照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠右側尾殼核部位，對大鼠顱頂目標區域脫毛，將麻醉后備皮的大鼠固定于立體定位儀上；B.腦出血模型建立；采用超聲造影劑對目標大鼠靜脈注射，并結合超聲設備，利用超聲探頭于大鼠顱頂目標區域覆蓋，利用超聲造影劑形成血腦屏障開放，血液由血管內部向腦實質滲出；C.生物模型評價；針對蘇醒后的大鼠，按照其動作和行為評分，同時采用CT血管造影成像詳細檢查出血區域；其CT血管造影成像所形成的出血范圍主要為下表所示：根據上表將大鼠出血范圍進行記錄和標記，隨后按照下一步驟中的神經功能評分，結合其出血部位進一步評價出血范圍的多少、出血量的多少形成輔助性評價，用以針對后續實驗組的數據收集和記錄，方便形成完整且詳細的評價流程。D.實驗動物分組和檢驗；將實驗動物按照模型對照組、實驗組、3-MA抑制劑組和3-MA抑制劑式實驗組分類，實驗完成后即采用神經行為觀測、染色檢測和腦組織檢測法，驗證最終實驗結果；上述組別中，每組24只，再將各組隨機分為4個時間亞組，即造模后6h、24h、72h和7d，每亞組6只，無需空白組，本次實驗流程設計為針灸實驗，分析在“針灸”狀態下，腦出血組織中“磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)”指標變化，并分析：針刺抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的表達；實驗組于造模后6小時開始以毫針由患側百會穴透刺曲鬢穴，每24小時針刺一次，參照《實驗動物穴位圖譜》取穴，進針1.5cm，留針30min，每5min捻轉1次，每次5min；3-MA抑制劑組在造模前15分鐘于前囟點右1.5mm，后0.8mm定位鉆孔注射抑制劑3-MA(400nm)；3-MA抑制劑式實驗組于注射抑制劑和建模后，給予與針刺組相同的針刺方法進行干預。步驟C中，大鼠造模后平均蘇醒時間約為2小時，后將大鼠放置于無蓋木質空箱子內，觀察其前爪形態及行走步態等體征，針對動作和行為的評分標準如下：(1)大鼠與造模前并無異樣，可正常自由行走，即為無神經功能缺損，計0分；(2)大鼠病灶對側前爪于行走或靜態時不能完全伸展，計1分；(3)大鼠行走時向病本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，其特征在于，具體包括如下步驟：/nA.準備工作；/n選取SPF級大鼠，月齡均為3-9個月，體重為250-500g，按照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠右側尾殼核部位，對大鼠顱頂目標區域脫毛，將麻醉后備皮的大鼠固定于立體定位儀上；/nB.腦出血模型建立；/n采用超聲造影劑對目標大鼠靜脈注射，并結合超聲設備，利用超聲探頭于大鼠顱頂目標區域覆蓋，利用超聲造影劑形成血腦屏障開放，血液由血管內部向腦實質滲出；/nC.生物模型評價；/n針對蘇醒后的大鼠，按照其動作和行為評分，同時采用CT血管造影成像詳細檢查出血區域；/nD.實驗動物分組和檢驗；/n將實驗動物按照模型對照組、實驗組、3-MA抑制劑組和3-MA抑制劑式實驗組分類，實驗完成后即采用神經行為觀測、染色檢測和腦組織檢測法，驗證最終實驗結果。/n

【技術特征摘要】
1.一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，其特征在于，具體包括如下步驟：
A.準備工作；
選取SPF級大鼠，月齡均為3-9個月，體重為250-500g，按照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠右側尾殼核部位，對大鼠顱頂目標區域脫毛，將麻醉后備皮的大鼠固定于立體定位儀上；
B.腦出血模型建立；
采用超聲造影劑對目標大鼠靜脈注射，并結合超聲設備，利用超聲探頭于大鼠顱頂目標區域覆蓋，利用超聲造影劑形成血腦屏障開放，血液由血管內部向腦實質滲出；
C.生物模型評價；
針對蘇醒后的大鼠，按照其動作和行為評分，同時采用CT血管造影成像詳細檢查出血區域；
D.實驗動物分組和檢驗；
將實驗動物按照模型對照組、實驗組、3-MA抑制劑組和3-MA抑制劑式實驗組分類，實驗完成后即采用神經行為觀測、染色檢測和腦組織檢測法，驗證最終實驗結果。


2.根據權利要求1所述的一種大腦出血模型鼠的建立和評價方法，其特征在于，所述步驟C中，大鼠造模后平均蘇醒時間約為2小時，后將大鼠放置于無蓋木質空箱子內，觀察其前爪形態及行走步態等體征，針對動作和行為的評分標準如下：
(1)大鼠與造模前并無異樣，可正常自由行走，即為無神經功能缺損，計0分；
(2)大鼠病灶對側前爪于行走或靜態時不能完全伸展，計1分；
(3)大鼠...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉真，杜永偉，
申請(專利權)人：劉真，
類型：發明
國別省市：江西;36