一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體為一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，包括如下步驟：步驟1：將肝癌組織標本的表面清洗并去除脂肪組織；步驟2：將組織剪成小塊接種到孔板中并采用初級培養基培養；步驟3：待腫瘤浸潤淋巴細胞爬出孔板達一定數量后，將腫瘤浸潤淋巴細胞和飼養細胞混合接種并加入加入全培養基中培養；步驟4：培養至飼養細胞至少部分死亡后，收集細胞凍存，得到腫瘤浸潤淋巴細胞。該方法快速可靠且性價比高，經過本發明專利技術的方法能夠在較短時間內獲得足夠數目的淋巴細胞，同時這些淋巴細胞亦具有相當的活力，可用于ACT等細胞治療，為CAR?T、TCR?T等治療方法提供良好基礎。

【技術實現步驟摘要】
一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法
本專利技術涉及生物
，具體地說，涉及一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法。
技術介紹
肝癌是世界第四最常見腫瘤相關死亡原因，其五年生存率只有18％，是第二最常見致死腫瘤，僅次于胰腺癌。肝癌中有接近90％的病理類型為肝細胞癌，常見的發病危險因素為：肝硬化、年齡、種族、性別以及肝臟損害程度，乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染已成為肝癌發病的兩個重要原因之一。肝癌患者通常合并分子病理學的改變，接近30％早起肝癌患者存在免疫活化，但于此同時，亦有25％患者沒有免疫浸潤。早期肝癌可選擇腫瘤消融術、手術切除、肝移植等治療方式，但晚期肝癌患者可供選擇的方案不多，常見的一線用藥未索拉非尼和侖伐替尼，雖然同時亦有許多臨床試驗在進行中，但效果差強人意。因此，開發新的肝癌治療方法尤為重要。腫瘤免疫治療現正成為研究熱點，ACT(Adaptivecelltransfer)療法為腫瘤晚期病人帶來一線希望。但體外淋巴細胞的培養、擴增以及如何能在短時間內獲得足夠數目的可以用于治療的細胞一直是個難題。本申請比較了手動研磨腫瘤組織和機器研磨腫瘤組織后使用淋巴細胞分離液和CD45磁珠純化后培養腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltratinglymphocyte,TIL)，以及單純組織塊爬出細胞培養TIL等各種不同方法，旨在發現一種快速可靠且性價比高的體外培養TIL的方法，在較短時間內獲得足夠數目的淋巴細胞，同時這些淋巴細胞亦具有相當的活力，可用于ACT等細胞治療，為CAR-T、TCR-T等治療方法提供良好基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，該方法快速可靠且性價比高，經過本專利技術的方法能夠在較短時間內獲得足夠數目的淋巴細胞，同時這些淋巴細胞亦具有相當的活力，可用于ACT等細胞治療，為CAR-T、TCR-T等治療方法提供良好基礎。在詳細描述本專利技術的方法之前，對本文涉及的相關技術名詞予以解釋：腫瘤浸潤淋巴細胞：tumor-infiltratinglymphocyte,TIL；rhIL-2：重組人白介-素2；HEPES：Good’s緩沖試劑,中文全稱為N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；RMPI-1640：RoswellParkMemorialInstitute洛斯維·帕克紀念研究所1640培養基；OKT3：抗人成熟T細胞共同分化抗原CD3的單克隆抗體；PBS：磷酸緩沖鹽溶液。本專利技術提供的技術方案為：一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，包括如下步驟：步驟1：將肝癌組織標本的表面清洗并去除脂肪組織；步驟2：將組織剪成小塊接種到孔板中并采用初級培養基培養；步驟3：待腫瘤浸潤淋巴細胞爬出孔板達一定數量后，將腫瘤浸潤淋巴細胞和飼養細胞混合接種并加入加入全培養基中培養；步驟4：培養至飼養細胞至少部分死亡后，收集細胞凍存，得到腫瘤浸潤淋巴細胞；其中初級培養基中含10％人AB血清、6000U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、RMPI-1640；所述全培養基中含10％人AB血清、500U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ng/mlOKT3、RMPI-1640。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟2和步驟3的培養條件均為：在孵箱中以37℃，5％CO2培養。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟2中的組織剪成1～2mm3大小的小塊，孔板為24孔板。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟3中，待腫瘤浸潤淋巴細胞爬出孔板不少于105個細胞后進行后續操作。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟2和步驟3之間，需要每隔1日更換初級培養基。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟3中，腫瘤浸潤淋巴細胞和飼養細胞的比例為1:100。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟3中接種于24孔板，所述步驟3和步驟4之間還包括：隔日觀察細胞并進行換液，待鏡下可見一定量的腫瘤浸潤淋巴細胞增殖團時，進行傳代處理；經傳代處理，待腫瘤浸潤淋巴細胞長滿2個24孔板的孔時，轉到6孔板中，并隔日使用全培養基換液。在上述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法中，所述步驟4在步驟1之后10天進行。有益效果：(1)操作便捷：無需gentleMACS等儀器對組織塊進行勻漿消化處理，只需要簡單的一把捏子和眼科剪將組織剪成小塊培養；(2)經濟：無需腫瘤解離試劑盒等昂貴試劑，只需RMPI-1640、雙抗、rhIL-2、OKT-3等簡單試劑便可對腫瘤浸潤淋巴細胞進行培養；(3)培養耗時相對短：從獲得組織到收取細胞凍存，平均培養時間為20天左右；(4)獲得的細胞總數多，淋巴細胞純度高，并可保持與day0數據一致的CD4、CD8細胞表型。附圖說明圖1為不同的組織培養方法的效果曲線圖。具體實施方式下面結合具體實施方式，對本專利技術的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本專利技術的任何限制。原料說明：實施例一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，包括如下步驟1)使用PBS將肝癌組織標本表面的血沖洗干凈后用鑷子、眼科剪等去除多余的脂肪組織，將組織剪成數個1～2mm3大小的小塊,接種至24孔板中，加入初級培養基(含10％人AB血清、6000U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、RMPI-1640)1.5ml，置于孵箱中，37℃，5％CO2培養；2)每隔1天觀察細胞爬出情況，并使用初級培養基進行換液處理；3)待鏡下觀察細胞爬出較多，計數大約到105個細胞時，將TIL與輻照過的PBMC(即飼養細胞)按1:100進行混合接種，加入全培(含10％人AB血清、500U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ng/mlOKT3、RMPI-1640)置于孵箱中，37℃，5％CO2進行培養；4)隔日觀察細胞并進行換液，待鏡下可見較多細胞增殖團時，進行傳代處理；5)待長滿2個24孔板的孔時，轉到6孔板中，并隔日使用全培換液；6)待飼養細胞死亡(一般得培養至10天后)時，收取細胞凍存。本專利技術的優勢在于：(1)操作便本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，其特征在于，包括如下步驟：/n步驟1：將肝癌組織標本的表面清洗并去除脂肪組織；/n步驟2：將組織剪成小塊接種到孔板中并采用初級培養基培養；/n步驟3：待腫瘤浸潤淋巴細胞爬出孔板達一定數量后，將腫瘤浸潤淋巴細胞和飼養細胞混合接種并加入加入全培養基中培養；/n步驟4：培養至飼養細胞至少部分死亡后，收集細胞凍存，得到腫瘤浸潤淋巴細胞；/n其中初級培養基中含10％人AB血清、6000U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、RMPI-1640；/n所述全培養基中含10％人AB血清、500U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mM HEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ng/ml OKT3、RMPI-1640。/n

【技術特征摘要】
1.一種新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：將肝癌組織標本的表面清洗并去除脂肪組織；
步驟2：將組織剪成小塊接種到孔板中并采用初級培養基培養；
步驟3：待腫瘤浸潤淋巴細胞爬出孔板達一定數量后，將腫瘤浸潤淋巴細胞和飼養細胞混合接種并加入加入全培養基中培養；
步驟4：培養至飼養細胞至少部分死亡后，收集細胞凍存，得到腫瘤浸潤淋巴細胞；
其中初級培養基中含10％人AB血清、6000U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、RMPI-1640；
所述全培養基中含10％人AB血清、500U/mlrhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ng/mlOKT3、RMPI-1640。


2.根據權利要求1所述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，其特征在于，所述步驟2和步驟3的培養條件均為：在孵箱中以37℃，5％CO2培養。


3.根據權利要求1所述的新型的原發性肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞的培養及體外擴增方法，其特征在于，所述步驟...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王戰會，謝詩，燕蓉，
申請(專利權)人：南方醫科大學南方醫院，
類型：發明
國別省市：廣東;44