一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法技術

本發明專利技術公開了一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，包括進行hUC?MSCs的分離、hUC?MSCs的體外擴增、收集P3代細胞進行降溫凍存、hUC?MSCs復蘇后與新鮮細胞進行比較統計和hUC?MSCs的檢測及鑒定。本發明專利技術的有益效果是：使用無血清培養貼壁法獲得大量且純度較高的MSCs，使用程序降溫儀進行程序降溫，降低對細胞的傷害，且保持較好的細胞活力，且得出凍存液比例為DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5時，凍存后活率最佳，復蘇后形態及生長速率與正常新鮮細胞培養基本一致。

【技術實現步驟摘要】
一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法
本專利技術涉及一種細胞活性研究方法，具體為一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，屬于醫學

技術介紹
間充質干細胞，MSC是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層，間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，人臍帶間充質干細胞已成為細胞治療的重要候選種子細胞,特別在各種退行性疾病和自身免疫性疾病的組織修復和免疫調節方面有良好的應用前景。但過度傳代會表現明顯衰老或凋亡，且長期體外培養易發生自發分化，失去多分化潛能，增殖、黏附能力下降，細胞凋亡率增加，而且臨床上細胞移植的供體和受體往往存在不同時性，很難保證即離即用，且充足的數量需求保證也會是一個問題，因此，本申請提出一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于為了解決上述問題而提供一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法。本專利技術通過以下技術方案來實現上述目的：一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟A：進行hUC-MSCs的分離，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm3的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養瓶底部，加入含無血清培養基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中，對hUC-MSCs進行分離；步驟B：hUC-MSCs的體外擴增，細胞鏡下觀察生長且密度達70-80%時，開始進行傳代操作，輕輕拍打培養瓶側壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養上清液棄掉，用PBS沖洗培養瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細胞，并計數，以5×103/cm2的接種密度進行傳代；步驟C：收集P3代細胞進行降溫凍存，將收集的細胞用程序降溫儀進行降溫凍存，并根據冷凍液濃度不同將其分為五組；步驟D：hUC-MSCs復蘇后與新鮮細胞進行比較統計，凍存10個月后將細胞置于37℃恒溫水浴箱中快速復蘇，融化后迅速移入離心管中，加入無血清培養基進行復蘇，吹吸混勻，離心棄去上清液后用臺盼藍溶液計數計算活率；步驟E：hUC-MSCs的檢測及鑒定，五組hUC-MSCs復蘇后進行培養，并對各組復蘇后進行形態學觀察。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟A中，在初次培養時，6天后培養液全量換液一次，鏡下觀察是否有細胞從組織塊周圍爬出，以后每3天換液一次，直至可見細胞爬出且密度達70-80%,可以考慮進行傳代操作。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟C和D中，細胞冷凍保存時，細胞降溫、復溫過程中必須經過-15℃～-60℃這一溫度區間，而該溫度區間對細胞具有一定的傷害性，選擇程序降溫儀進行程序降溫。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟C中，根據凍存液不同分為五組，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代細胞進行程序降溫凍存。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟E中，用MTT法比較細胞生長情況，加入無血清培養基進行培養，取復蘇后對數生長期細胞，消化成細胞懸液，以P3代未凍存細胞懸液為對照組，調整細胞密度，按每孔1*10^4接種96孔板，去除培養基，加入20微升MTT溶液，采用酶標儀分別測定5組及對照組細胞的吸光度，流式細胞儀檢測細胞周期，流式細胞儀檢測細胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105抗原。本專利技術的有益效果是：該間充質干細胞凍存液及其活性研究方法設計合理，步驟A中，在初次培養時，6天后培養液全量換液一次，鏡下觀察是否有細胞從組織塊周圍爬出，以后每3天換液一次，直至可見細胞爬出且密度達70-80%,可以考慮進行傳代操作，確保實驗研究用細胞的活性，減少實驗數據的誤差，保證分離的徹底性且方便傳代操作的穩定進行，步驟C和D中，細胞冷凍保存時，細胞降溫、復溫過程中必須經過-15℃～-60℃這一溫度區間，而該溫度區間對細胞具有一定的傷害性，選擇程序降溫儀進行程序降溫，降低在-15℃～-60℃這一溫度區間對細胞的傷害，減少實驗誤差，提高細胞存活率的精準度，步驟C中，根據凍存液不同分為五組，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代細胞進行程序降溫凍存，方便根據對比試驗得出更加精準的實驗數據，從而確定最佳凍存液濃度，步驟E中，用MTT法比較細胞生長情況，加入無血清培養基進行培養，取復蘇后對數生長期細胞，消化成細胞懸液，以P3代未凍存細胞懸液為對照組，調整細胞密度，按每孔1*10^4接種96孔板，去除培養基，加入20微升MTT溶液，采用酶標儀分別測定5組及對照組細胞的吸光度，流式細胞儀檢測細胞周期，流式細胞儀檢測細胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105抗原，根據五組細胞的生長情況以及復蘇后形態進行對比統計，得出凍存液比例為DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5時，凍存后活率最佳，復蘇后形態及生長速率與正常新鮮細胞培養基本一致。附圖說明圖1為本專利技術結構示意圖。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。請參閱圖1，一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟A：進行hUC-MSCs的分離，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm3的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養瓶底部，加入含無血清培養基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中，對hUC-MSCs進行分離；步驟B：hUC-MSCs的體外擴增，細胞鏡下觀察生長且密度達70-80%時，開始進行傳代操作，輕輕拍打培養瓶側壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養上清液棄掉，用PBS沖洗培養瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細胞，并計數，以5×103/cm2的接種密度進行傳代；步驟C：收集P3代細胞進行降溫凍存，將收集的細胞用程序降溫儀進行降溫凍存，并根據冷凍液濃度不同將其分為五組；步驟D：hUC-MSCs復蘇后與新鮮細胞進行比較統計本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：/n步驟A：進行hUC-MSCs的分離，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm

【技術特征摘要】
1.一種間充質干細胞凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：
步驟A：進行hUC-MSCs的分離，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm3的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養瓶底部，加入含無血清培養基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中，對hUC-MSCs進行分離；
步驟B：hUC-MSCs的體外擴增，細胞鏡下觀察生長且密度達70-80%時，開始進行傳代操作，輕輕拍打培養瓶側壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養上清液棄掉，用PBS沖洗培養瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細胞，并計數，以5×103/cm2的接種密度進行傳代；
步驟C：收集P3代細胞進行降溫凍存，將收集的細胞用程序降溫儀進行降溫凍存，并根據冷凍液濃度不同將其分為五組；
步驟D：hUC-MSCs復蘇后與新鮮細胞進行比較統計，凍存10個月后將細胞置于37℃恒溫水浴箱中快速復蘇，融化后迅速移入離心管中，加入無血清培養基進行復蘇，吹吸混勻，離心棄去上清液后用臺盼藍溶液計數計算活率；
步驟E：hUC-MSCs的檢測及鑒定，五組hUC-MSCs復蘇后進行培養，并對各組復蘇后進行形態學觀察。


2.根據權利要求1所述的一種間充質干細胞凍...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王小龍，李雯雯，石珂，王彥，
申請(專利權)人：河南省銀豐生物工程技術有限公司，銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41