一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法技術

本發明專利技術公開了一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，包括確定參與人員、確定實驗儀器和試劑、Muse細胞的分選、Muse細胞的體外擴增、Muse細胞的鑒定。本發明專利技術的有益效果是：通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA?3陽性的細胞，并在MC培養基、poly?HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮?貼壁?懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力。通過對第3代Muse細胞的骨、成脂誘導，可使細胞分化為脂肪細胞和成骨細胞。證明本項目成功建立了一種人臍帶來源Muse細胞培養方案。

【技術實現步驟摘要】
一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法
本專利技術涉及一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，具體為一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，屬于細胞研究

技術介紹
隨著干細胞技術在治療疾病中的發展，人們越來越認識到干細胞技術對于人類健康的促進作用。近年來發現來源于間充質干細胞的Muse細胞，在干細胞移植方面具有抗應激能力強，歸巢效果好，成瘤性低等特點，為干細胞治療技術的進一步提高打開了新的方向。臍帶間充質干細胞本身具有來源豐富，取材方便，對供者無創傷，易于分離培養和體外擴增，倫理限制較少，細胞更為原始等優點,使得Muse細胞的提取、純化、擴增更加方面有效。目前對臍帶源間充質干細胞中Muse細胞的培養的相關報道并不多見，其細胞的篩選、鑒定等的研究也鮮有報道。從臍帶組織中分離培養Muse細胞的前景廣闊，因此本項目擬通過實驗建立一套完備而穩定的操作工藝，以獲得較高純度的Muse細胞。對今后Muse細胞在間充質干細胞治療組織再生，免疫調節等臨床應用提供一定參考。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于為了解決問題而提供一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法。本專利技術通過以下技術方案來實現上述目的：一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，包括以下步驟：步驟一、確定參與人員。步驟二、確定實驗儀器和試劑。步驟三、Muse細胞的分選，通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA-3陽性的細胞，并在MC培養基、poly-HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮-貼壁-懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力。步驟四、Muse細胞的體外擴增，對分選獲得的Muse細胞，采用懸浮培養-貼壁培養-懸浮培養的方式進行擴增。步驟五、Muse細胞的鑒定，采用FACS，從培養的臍帶來源的間充質細胞，分選出抗SSEA-3抗體陽性的細胞（Muse細胞）；進行堿性磷酸酶染色，用免疫熒光染色、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western-blot檢測其多能性。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟二中，實驗儀器和試劑包括以下：流式細胞儀、CO2培養箱、臺式離心機、生物安全柜、顯微鏡、熒光顯微鏡及照相系統、酶標儀間充質干細胞無血清條件培養基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉諾生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105（BDBiosciences），anti-CD34（SantaCruzBiotechnology），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導分化培養液、茜素紅、油紅O（Cyagen）、Anti-SSEA3、高糖DMEM、胎牛血清。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟四中，Muse細胞的體外擴增包括以下步驟：（1）、將獲得的MSC細胞通過200目細胞過濾器。在振蕩器上，用SSEA3–FITC結合的抗體孵育，室溫20分鐘；（2）、人IgG-FITC用作同型對照，PI染色排除FACS分析中的死亡細胞，分選獲得的單個細胞；（3）、用MC培養基懸浮培養在Poly-HEMA包被6孔板里，每兩天加入500ulMC培養基，四天后以1000轉/分3分鐘、800轉/分5分鐘、600轉/分5分鐘低速離心去除死亡的單個細胞；（4）、隨后繼續懸浮培養，7天后將不再長大的Muse細胞簇離心重種到基質膠包被6孔板，觀察其貼壁后生長情況，待細胞達90%融合后，以胰酶消化，再重新接種到Poly-HEMA包被6孔板用MC培養基懸浮培養。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟五中，Muse細胞的的鑒定包括以下步驟：（1）、取生長狀態良好的第3代細胞分別進行以下鑒定：（2）、CCK-8法檢測細胞活性；（3）、流式細胞儀檢測細胞周期；（4）、流式細胞儀檢測細胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及SSEA3抗原；（5）、加入成脂、成骨誘導分化液檢測成脂、成骨誘導分化能力。本專利技術的有益效果是：該人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法設計合理，通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA-3陽性的細胞，并在MC培養基、poly-HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮-貼壁-懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力。通過對第3代Muse細胞的骨、成脂誘導，可使細胞分化為脂肪細胞和成骨細胞。證明本項目成功建立了一種人臍帶來源Muse細胞培養方案。附圖說明圖1為本專利技術流程示意圖。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。請參閱圖1，一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，包括以下步驟：步驟一、確定參與人員。步驟二、確定實驗儀器和試劑。步驟三、Muse細胞的分選，通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA-3陽性的細胞，并在MC培養基、poly-HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮-貼壁-懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力。步驟四、Muse細胞的體外擴增，對分選獲得的Muse細胞，采用懸浮培養-貼壁培養-懸浮培養的方式進行擴增。步驟五、Muse細胞的鑒定，采用FACS，從培養的臍帶來源的間充質細胞，分選出抗SSEA-3抗體陽性的細胞（Muse細胞）；進行堿性磷酸酶染色，用免疫熒光染色、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western-blot檢測其多能性。進一步的，在本專利技術實施例中，所述步驟二中，實驗儀器和試劑包括以下：流式細胞儀、CO2培養箱、臺式離心機、生物安全柜、顯微鏡、熒光顯微鏡及照相系統、酶標儀間充質干細胞無血清條件培養基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉諾生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105（BDBiosciences），anti-CD34（SantaCruzBiotechnology），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導分化培養液、茜素紅、油紅O（Cyagen）、Anti-SSEA3、高糖DMEM、胎牛血清。進一步的，在本專利技術實施例中，所述步驟四中，Muse細胞的體外擴增包括以下步驟：（1）、將獲得的MSC細胞通過200目細胞過濾器。在振蕩器上，用SSEA3–FITC結合的抗體孵育，室溫20分鐘；（2）、人IgG-FITC用作同型對照，PI染色排除FACS分析中的死亡細胞，分選獲得的單個細胞；（3）、用MC培養基懸浮培養在Poly-HEMA包被6孔板里，每兩天加入500ulMC培養基，四天后以1000轉/分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：/n步驟一、確定參與人員；/n步驟二、確定實驗儀器和試劑；/n步驟三、Muse細胞的分選，通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA-3陽性的細胞，并在MC培養基、poly-HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮-貼壁-懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力；/n步驟四、Muse細胞的體外擴增，對分選獲得的 Muse 細胞，采用懸浮培養-貼壁培養-懸浮培養的方式進行擴增；/n步驟五、Muse細胞的鑒定，采用 FACS，從培養的臍帶來源的間充質細胞，分選出抗SSEA-3 抗體陽性的細胞；進行堿性磷酸酶染色，用免疫熒光染色、逆轉錄聚合酶鏈反應及Western-blot 檢測其多能性。/n

【技術特征摘要】
1.一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：
步驟一、確定參與人員；
步驟二、確定實驗儀器和試劑；
步驟三、Muse細胞的分選，通過流式細胞儀分選原代培養的真皮成纖維細胞SSEA-3陽性的細胞，并在MC培養基、poly-HEMA包被板條件下培養Muse細胞簇，觀察其懸浮-貼壁-懸浮、增殖擴增這一自我更新的能力；
步驟四、Muse細胞的體外擴增，對分選獲得的Muse細胞，采用懸浮培養-貼壁培養-懸浮培養的方式進行擴增；
步驟五、Muse細胞的鑒定，采用FACS，從培養的臍帶來源的間充質細胞，分選出抗SSEA-3抗體陽性的細胞；進行堿性磷酸酶染色，用免疫熒光染色、逆轉錄聚合酶鏈反應及Western-blot檢測其多能性。


2.根據權利要求1所述的一種人臍帶來源Muse細胞的篩選與鑒定方法，其特征在于：所述步驟二中，實驗儀器和試劑包括以下：
流式細胞儀、CO2培養箱、臺式離心機、生物安全柜、顯微鏡、熒光顯微鏡及照相系統、酶標儀間充質干細胞無血清條件培養基、0.25%胰酶，anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105，anti-CD34，anti-CD44，細胞周期即時檢測試劑盒，成骨及成脂誘導分化培養液、茜素紅、油紅O、Anti-SSEA3、高糖DMEM、胎牛血清。


3.根據權...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭曉丹，程志遠，馬晴，陳少輝，
申請(專利權)人：河南省銀豐生物工程技術有限公司，銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41