一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法技術

本發明專利技術公開了一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，包括免疫細胞CIK的分離、細胞CIK的無血清體外擴增、分析細胞CIK的生長曲線、分析細胞CIK表面抗原表達、分析細胞CIK周期、免疫細胞CIK的凍存及復蘇、免疫細胞各項指標檢測。無血清培養基懸浮培養體系，分離獲得的免疫細胞CIK具有增殖能力，利用細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，細胞活性在四種細胞凍存液中的細胞活性最高，在90%以上，流式細胞儀檢測結果表明，凍存前的細胞與凍存復蘇后的細胞的免疫表型無明顯差異，均具有免疫細胞的免疫表型，流式細胞術檢測細胞凋亡實驗表明，細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，晚期凋亡的細胞數最少，且未發生凋亡的細胞數最多。

【技術實現步驟摘要】
一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法
本專利技術涉及一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，具體為一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，屬于細胞研究

技術介紹
血液系統惡性腫瘤的發病率逐年升高，其死亡率在國內外腫瘤排名中處于前十位，傳統療法(如放療、化療、手術、造血干細胞移植等)能使部分患者生存獲益，但復發、難治、耐藥等現象仍是目前面臨的巨大挑戰。近年來，隨著分子生物學、免疫學等先進技術的發展，細胞免疫治療已成為包括惡性血液病在內的多種腫瘤治療的重要手段，被Science雜志列為2013年十大科學突破之首。臍血又稱胎盤血或臍帶血。臍血來源豐富、采集簡單，具有配型要求低、免疫排斥發病率低、移植費用低和移植成功率高等優點，已被廣泛地應用于白血病及非惡性血液病、先天性免疫缺陷等多種疾病治療，因此臍血已成為繼骨髓和外周血后的第三大造血干細胞的來源。隨著臍血來源造血干細胞的應用，其產生的儲存問題已經成為熱點。因此，評價不同凍存液凍存臍血來源單個核細胞的效果，對建立安全穩定的臍血庫至關重要，是當前刻不容緩的問題。CIK細胞具有強大的殺瘤活性，具有TIL、LAK細胞所無法比擬的優勢，但誘導CIK細胞需要發費很長的時間，在臨床應用上需要多次誘導和采血，給患者造成了極大的痛苦和不必要的麻煩。也有人提出將對數期生長的CIK細胞像其他傳代細胞一樣低溫保存，需要時再復蘇，但是現有的技術使得復蘇的細胞活性偏低，達不到我們高效增殖的目的。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于為了解決問題而提供一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法。本專利技術通過以下技術方案來實現上述目的：一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟一、免疫細胞CIK的分離包括以下過程：（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。步驟二、細胞CIK的無血清體外擴增包括以下步驟：（1）、免疫細胞的起始培養；離心收集全部細胞，用30mlCIK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlCIK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlCIK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加CIK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養。（2）免疫細胞的無血清培養；細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的CIK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的CIK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的CIK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞。步驟三、分析細胞CIK的生長曲線。步驟四、分析細胞CIK表面抗原表達。步驟五、分析細胞CIK周期。步驟六、免疫細胞CIK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞CIK的凍存實驗和一組對照組，且五組實驗分別凍存10天和30天。步驟七、免疫細胞各項指標檢測。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟一中，混勻后均勻緩慢地加至相應的A液上層，形成完整的界面，設定離心參數升6降4，1600rpm，離心20min，吸棄第一層上清，小心輕柔地將第二層的白色細胞層吸至潔凈50ml離心管中，各管中加NA，稀釋混勻，定容至50ml/管，設定離心參數升9降7，2000rpm，離心8min，吸棄上清，加10mlNA/管，重懸細胞。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟三中，采用臺盼藍染色法檢測細胞活性，并繪制出相應的細胞生長曲線。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟四中，采用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD56、CD8抗原。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟五中，采用流式細胞儀檢測細胞周期。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟六中，四組實驗組和一組對照組分別是：（1）、細胞凍存液1：A液：20%的20%人血白蛋白，10%的15%右旋糖酐/5%葡萄糖注射液；B液：31.25%勃脈力A（復方電解質注射液），31.25%的5%葡萄糖/0.45%氯化鈉注射液，7.5%DMSO，配置完畢后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（2）、細胞凍存液2：采用臍帶組織凍存的B液，購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（3）、友康凍存液：購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（4）、亙諾凍存液：購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（5）、對照組：新鮮細胞。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟七中，可以通過核細胞計數、活細胞檢測、集落培養、免疫細胞檢測等對CIK免疫細胞進行各項指標檢測。本專利技術的有益效果是：該免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法設計合理，應用無血清培養基懸浮培養體系，分離獲得的免疫細胞CIK具有較強的增殖能力，利用細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，細胞活性在四種細胞凍存液中的細胞活性最高，在90%以上，流式細胞儀檢測結果表明，凍存前的細胞與凍存復蘇后的細胞的免疫表型無明顯差異，均具有免疫細胞的免疫表型，流式細胞術檢測細胞凋亡實驗表明，細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，晚期凋亡的細胞數最少，且未發生凋亡的細胞數最多。附圖說明圖1為本專利技術流程示意圖。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。請參閱圖1，一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟一、免疫細胞CIK的分離包括以下過程：（4）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；（5）、外周本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：/n步驟一、免疫細胞CIK的分離包括以下過程：/n（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；/n（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；/n（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。/n步驟二、細胞CIK的無血清體外擴增包括以下步驟：/n（1）、免疫細胞的起始培養；/n離心收集全部細胞，用30ml CIK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlCIK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlCIK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加CIK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養。/n（2）免疫細胞的無血清培養；/n細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的CIK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的CIK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的CIK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞；/n步驟三、分析細胞CIK的生長曲線；/n步驟四、分析細胞CIK表面抗原表達；/n步驟五、分析細胞CIK周期；/n步驟六、免疫細胞CIK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞CIK的凍存實驗和一組對照組，且五組實驗分別凍存10天和30天；/n步驟七、免疫細胞各項指標檢測。/n...

【技術特征摘要】
1.一種免疫細胞CIK的凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：
步驟一、免疫細胞CIK的分離包括以下過程：
（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；
（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；
（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。
步驟二、細胞CIK的無血清體外擴增包括以下步驟：
（1）、免疫細胞的起始培養；
離心收集全部細胞，用30mlCIK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlCIK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlCIK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加CIK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養。
（2）免疫細胞的無血清培養；
細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的CIK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的CIK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的CIK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞；
步驟三、分析細胞CIK的生長曲線；
步驟四、分析細胞CIK表面抗原表達；
步驟五、分析細胞CIK周期；
步驟六、免疫細胞CIK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞CIK的凍...

【專利技術屬性】
技術研發人員：石珂，陳樂，楊藝，程志遠，
申請(專利權)人：河南省銀豐生物工程技術有限公司，銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41