小柴胡復方制劑指紋圖譜及其構建方法和小柴胡復方制劑的含量測定方法技術

本發(fā)明專利技術屬于中藥制劑的質(zhì)量檢測技術領域，具體提供了小柴胡復方制劑指紋圖譜及其構建方法和小柴胡復方制劑的含量測定方法，其中，小柴胡復方制劑指紋圖譜的構建方法包括以下步驟，(1)小柴胡復方制劑供試品溶液的制備；(2)取小柴胡復方制劑供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲酸的水溶液?乙腈為流動相梯度洗脫，并通過反復試驗得到洗脫程序，在本發(fā)明專利技術的洗脫條件下，不僅顯著增加了共有峰個數(shù)，而且明顯提高了共有特征峰的分離度，大大縮短檢測時間，而且各共有峰峰形良好且無干擾，從而能夠更加全面、清楚、有效的對小柴胡復方制劑進行質(zhì)量檢測。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
小柴胡復方制劑指紋圖譜及其構建方法和小柴胡復方制劑的含量測定方法
本專利技術屬于中藥制劑的質(zhì)量檢測
，具體涉及一種小柴胡復方制劑指紋圖譜及其構建方法和小柴胡復方制劑的含量測定方法。
技術介紹
小柴胡顆粒是由柴胡、黃芩、黨參、大棗水提部分與姜半夏、生姜70％醇提部分混合濃縮、制粒得到的復方制劑。用于治療外感病，邪犯少陽證，癥見往來寒熱、胸脅苦滿、食欲不振、心煩喜嘔、口苦咽干。國家食品藥品監(jiān)督管理局共有98家企業(yè)具有小柴胡顆粒生產(chǎn)批號，現(xiàn)行中國藥典(2020年版)僅對小柴胡顆粒中黃芩苷進行含量限定要求。現(xiàn)有技術中已有研究建立小柴胡顆粒指紋圖譜檢測方法，但這些指紋圖譜均是建立在同一廠家的多個批次樣品上，不能代表市面上不同廠家生產(chǎn)的小柴胡顆粒樣品。例如，專利文獻CN105786771A中公開了一種小柴胡復方制劑的指紋圖譜檢測方法，然而該方法構建的指紋圖譜存在共有特征峰個數(shù)少，各特征峰分離度差，耗時長的問題。因此，研究一種新的有效、準確、全面地檢測小柴胡復方制劑質(zhì)量的方法成為了亟待解決的問題。
技術實現(xiàn)思路
因此，本專利技術的目的在于解決現(xiàn)有技術中小柴胡復方制劑指紋圖譜的構建方法得到的指紋圖譜的共有峰個數(shù)少、分離度不佳以及耗時長的問題，提供了一種小柴胡復方制劑指紋圖譜及其構建方法。具體的，本專利技術公開了一種小柴胡復方制劑紋圖譜的構建方法，包括以下步驟，(1)小柴胡復方制劑供試品溶液的制備；(2)取小柴胡復方制劑供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-含甲酸的水溶液為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫程序包括0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流動相中乙腈的體積百分數(shù)為：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法，步驟(1)包括：稱取小柴胡復方制劑，加溶劑提取，得到提取液，固液分離，取液體，即為供試品溶液。某些優(yōu)選的實施方式中，本專利技術通過使用正交表對不同來源、不同性質(zhì)的原料藥進行合理組合，然后按照藥典方法制得多批柴胡顆粒標準湯劑凍干粉，利用這些批次小柴胡顆粒標準湯劑凍干粉構建生成了小柴胡復方制劑對照指紋圖譜，建立的指紋圖譜方法更加適用于市面上小柴胡顆粒的評價。某些優(yōu)選的實施方式中，本專利技術公開了一種小柴胡復方制劑紋圖譜的構建方法，包括以下步驟，(1)收集至少6批次以上的北柴胡、黃芩、黨參、甘草與姜半夏飲片，收集大棗與生姜的合格飲片，按照中國藥典對所有收集的飲片進行含量測定和浸出物含量測定，得到浸出物含量結果和含量測定結果。將浸出物含量結果和含量測定結果進行排序，得到每批次每種原料藥的序列號。按照如下公式計算每批次每種原料藥的得分。得分＝同一批同種原料藥浸出物含量測定結果排序號*0.5+同一批同種原料藥含量測定結果的排列號*0.5。將各批次的北柴胡、黃芩、黨參、甘草與姜半夏飲片按照得分情況篩選出高、中、低分為三個質(zhì)量水平的批次。其中高水平是指得分最高的批次，中水平是指得分中位數(shù)水平對應的批次，低水平是指得分最低的批次。按照5因素3水平正交表選擇不同批次的北柴胡、黃芩、黨參、甘草與姜半夏飲片制備小柴胡顆粒標準湯劑，共得到18批小柴胡顆粒標準湯劑。(2)取步驟(1)制得的小柴胡顆粒標準湯劑制備小柴胡復方制劑供試品溶液；(3)取小柴胡復方制劑供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，含甲酸的水溶液為流動相B，梯度洗脫，梯度洗脫程序包括0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流動相中乙腈的體積百分數(shù)為：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。具體的，將浸出物含量結果和含量測定結果同時按照從低到高或者從高到低分別進行排序，得到每批次每種原料藥的序列號。例如，北柴胡有9批樣品，從最高水平的浸出物含量到最低水平的浸出物含量的序列號依次為9，8，7，6，5，4，3，2，1。大棗與生姜飲片作為次要藥味僅收集2批次以上，選擇1批合格的制備小柴胡顆粒標準湯劑。步驟(1)還包括，另選擇質(zhì)量水平為中水平黃芩、黨參、甘草與姜半夏飲片分別與不同產(chǎn)地的南柴胡飲片，制備南柴胡組成的小柴胡顆粒標準湯劑。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法，滿足A-C中任意一項或者多項：A、步驟1)中，加入10-40倍量溶劑，提取方式為回流提取或者超聲提取，提取時間為0.3-5h。優(yōu)選的，提取時間為0.3-5h，更優(yōu)選為30-60min。所述倍量表示每克小柴胡復方制劑中加入溶劑的毫升數(shù)。優(yōu)選的，小柴胡復方制劑經(jīng)粉粹處理得到粉末，取過60目篩的小柴胡復方制劑粉末。B、所述固液分離獨立地選自離心或者過濾；C、所述溶劑選自甲醇、水和乙醇中的至少一種。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法中，小柴胡復方制劑是以柴胡、黃芩、黨參、甘草、大棗、生姜、姜半夏為原料藥按照常規(guī)技術手段制得的復方制劑。按照重量份數(shù)計，小柴胡復方制劑包括如下原料：柴胡21-28份、黃芩6-13份、黨參6-13份、生姜6-13份、姜半夏6-13份、甘草6-13份和大棗6-13份。對于這些復方制劑均可采用本專利技術的方法構建指紋圖譜。小柴胡復方制劑優(yōu)選為小柴胡湯的固體制劑、半固體制劑和液體制劑，更優(yōu)選為小柴胡顆粒、小柴胡膠囊和小柴胡片中的至少一種。小柴胡復方制劑可以按照常規(guī)技術手段制備，例如但不局限于中國藥典規(guī)定的方法。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法，所述步驟(1)包括：取過40-80目篩的小柴胡復方制劑粉末0.7-3.0g，加入25-75ml甲醇，超聲提取20-60min，室溫放置冷卻后，甲醇補重，取上清液過0.22μm有機濾器，取濾液，作為供試品溶液。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法，所述步驟(2)包括：檢測波長190-800nm，流速為0.2-0.3ml/min，柱溫30-40℃，進樣量為2-10μl，優(yōu)選的,254nm為檢測波長，流速0.3ml/min，柱溫為35℃。根據(jù)本專利技術任一項所述的構建方法，梯度洗脫程序包括0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～3本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
1.一種小柴胡復方制劑指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括以下步驟，/n(1)小柴胡復方制劑供試品溶液的制備；/n(2)取小柴胡復方制劑供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-含甲酸的水溶液為流動相進行梯度洗脫；梯度洗脫程序包括：/n0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流動相中乙腈的體積百分數(shù)為：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。/n

【技術特征摘要】
1.一種小柴胡復方制劑指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括以下步驟，
(1)小柴胡復方制劑供試品溶液的制備；
(2)取小柴胡復方制劑供試品溶液采用高效液相色譜法檢測，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-含甲酸的水溶液為流動相進行梯度洗脫；梯度洗脫程序包括：
0-2min→2-4min→4-7.5min→6-10.5min→9-16min→13-18min→15-21min→18-22min→19-24min→21-30min→23-31min，流動相中乙腈的體積百分數(shù)為：15-17％→15-20％→20-28％→28％→28-35％→35-50％→50-52％→52％→52-60％→60-80％→65-80％。


2.根據(jù)權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)包括：稱取小柴胡復方制劑，加溶劑提取，得到提取液，固液分離，取液體，即為供試品溶液，優(yōu)選地，所述步驟(1)還滿足如下A-C中的任意一項或者多項：
A、加入10-40倍量溶劑，提取方式為回流提取或者超聲提取，提取時間為0.3-5h；
B、所述固液分離選自離心或者過濾；
C、溶劑選自甲醇、水和乙醇中的至少一種。


3.根據(jù)權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)還滿足如下1)-3)項中的任意一項或者多項：
1)所述梯度洗脫程序包括：0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～30min,60～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈；
或者，所述梯度洗脫程序包括：0～2min,17vt％乙腈；2～4min,17～20vt％乙腈；4～6min,20～28vt％乙腈；6～9min,28vt％乙腈；9～13min,28～35vt％乙腈；13～15min,35～50vt％乙腈；15～18min,50～52vt％乙腈；18～19min,52vt％乙腈；19～21min,52～60vt％乙腈；21～23min,60～70vt％乙腈；23～25min,70vt％乙腈；25～27min,70～75vt％乙腈；27～30min,75～80vt％乙腈；
或者，所述梯度洗脫程序包括：0～2min,15vt％乙腈；2～4min,15～20vt％乙腈；4～7.5min,20～28vt％乙腈；7.5～10.5min,28vt％乙腈；10.5～16min,28～35vt％乙腈；16～18min,35～50vt％乙腈；18～21min,50～52vt％乙腈；21～22min,52vt％乙腈；22～24min,52～60vt％乙腈；24～27min,60～65vt％乙腈；27～30min,65～80vt％乙腈；30～31min,80vt％乙腈；
2)所述的含甲酸的水溶液中甲酸的體積百分數(shù)為0.1％-0.5％；
3)高效液相色譜法的色譜條件還包括：檢測波長為190-800nm，優(yōu)選為254nm；流速為0.2-0.3ml/min，優(yōu)選為0.3ml/min；柱溫30-40℃，優(yōu)選為35℃；進樣量為2-10μl，優(yōu)選為3μl。


4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的構建方法，其特征在于，所述的構建方法還包括采用柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、黨參炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2中的至少一種制備對照品溶液的步驟，以及按照權利要求1-3中任一所述的構建方法中的高效液相色譜法檢測對照品溶液得到對照品指紋圖譜的步驟；
優(yōu)選的，所述對照品溶液的制備方法包括如下步驟：取柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、黨參炔苷、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2對照品，加溶劑制成每1ml含柴胡皂苷b21.02-65μg、柴胡皂苷b11.25-80μg、黃芩苷40.16-2570μg、黃芩素4.14-265μg、漢黃芩苷7.34-470μg、黨參炔苷6.88-440μg、6-姜辣素3.44-220μg、甘草苷2.50-160μg、甘草酸5.78-370μg和甘草皂苷G21.02-65μg的混合對照品溶液；
更優(yōu)選的，所述溶劑選自純甲醇或者乙醇水溶液；所述乙醇水溶液中乙醇的體積分數(shù)不高于30％。


5.一種小柴胡復方制劑指紋圖譜，其特征在于，所述小柴胡復方制劑指紋圖譜是由權利要求1-4中任一所述的構建方法得到。


6.一種小柴胡復方制劑對照指紋圖譜，其特征在于，所述小柴胡復方制劑對照指紋圖譜選自如下(1)-(5)中的任意一項：
(1)其具有26個共有峰，保留時間分別為2.342min、2.966min、3.155min、7.076min、7.726m...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張雪，劉暉暉，吳宏偉，楊洪軍，林麗娜，馬鵬崗，
申請(專利權)人：華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44