一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法技術

本發明專利技術涉及乳酸菌誘變選育技術領域，提出了一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，包括以下步驟：S1、制備菌懸液：將出發菌株培養得菌液，轉接繼續培養至對數中期，離心、洗滌、濃縮，得懸液置于空平皿中備用；S2、紫外照射：將所述懸液置于紫外燈下照射；S3、復壯培養：將S2所得菌體重懸于新鮮培養基復壯培養；S4、青霉素處理：添加青霉素處理，稀釋，涂布于MC培養基培養；S5、篩選弱后酸化菌株。通過上述技術方案，解決了現有技術中的無法高效選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的問題。

【技術實現步驟摘要】
一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法
本專利技術涉及乳酸菌誘變選育
，具體的，涉及一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法。
技術介紹
乳酸菌指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。嗜熱鏈球菌作為乳酸菌中一個重要的類別，在發酵乳制品領域被廣泛應用。后酸化是指酸乳在包裝、運輸以及儲藏(銷售前)過程中菌株繼續緩慢產酸，導致消費者難以接受的過酸口感，嚴重影響產品的品質，縮短保質期，已成為發酵乳品企業關鍵的技術難題。
技術實現思路
本專利技術提出一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，解決了現有技術中的無法高效選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的問題。本專利技術的技術方案如下：一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，包括以下步驟：S1、制備菌懸液：將出發菌株培養得菌液，轉接繼續培養至對數中期，離心、洗滌、濃縮，得懸液置于空平皿中備用；S2、紫外照射：將所述懸液置于紫外燈下照射；S3、復壯培養：將S2所得菌體重懸于新鮮培養基復壯培養；S4、青霉素處理：添加青霉素處理，稀釋，涂布于MC培養基培養；S5、篩選弱后酸化菌株。作為進一步的技術方案，所述步驟S1的具體操作為：將出發菌株在M17培養基37℃培養12～18h，轉接至新鮮M17培養基，42℃培養至對數中期，離心，洗滌，濃縮得懸液。作為進一步的技術方案，所述步驟S2的具體操作為：紫外誘變儀提前預熱，將所述懸液在紫外燈下照射使得致死率>90％。作為進一步的技術方案，所述步驟S3的具體操作為：將S2所得菌體重懸于M17培養基，42℃培養至pH為4.4～4.5。作為進一步的技術方案，所述步驟S4的具體操作為：添加8～10ug/mL青霉素42℃處理0.5～1h，稀釋，涂布于MC培養基37℃培養。作為進一步的技術方案，所述步驟S5的具體操作為：標記MC培養基中透明圈較小的單菌落，挑取出繼續培養，培養后菌液接種于基礎配料中，插入pH電極發酵，進行挑選；所述透明圈小的單菌落具體為：數量百分比為10％以內的較小的單菌落。作為進一步的技術方案，所述挑選的標準為發酵前期pH與出發菌株下降一致，而后期下降緩慢的菌株。作為進一步的技術方案，所述MC培養基包括如下組分：大豆蛋白胨5～6g、牛肉浸粉3～4g、酵母浸粉3～4g、葡萄糖16～20g、乳糖16～20g、碳酸鈣8～12g、瓊脂12～16g、蒸餾水1L，pH控制在5.8～6.0。作為進一步的技術方案，所述M17培養基包括如下組分：大豆蛋白胨5～6g、酵母提取物5～6g、聚蛋白胨5～6g、抗壞血酸0.5～0.8g、牛肉浸膏2～2.5g、β-甘油磷酸二鈉18～20g、瓊脂12～15g、硫酸鎂0.5～1ml、蒸餾水1L，pH控制在7.0±0.1，所述硫酸鎂為1.0mol/L硫酸鎂水溶液。本專利技術的有益效果為：1、本專利技術通過紫外線誘變和青霉素處理的方法，結合快速篩選的方法，實現了對嗜熱鏈球菌后酸的弱化，紫外線誘變可顯著提高菌株的突變頻率，而青霉素可以通過抑制微生物細胞壁的合成將處于快速分裂期的細胞殺死，進而對生長代謝緩慢的菌株有明顯富集作用。2、菌株代謝產酸會降解MC培養基中的CaCO3，生成透明圈，且產酸對少與透明圈的大小呈正相關，本專利技術可以無需添加顯色劑只需根據透明圈大小便可初步挑選產酸弱的單株；pH在線酸化儀可以方便、快速的獲得菌株在奶基質中的pH變化曲線，進而復篩出前期產酸迅速而后期緩慢的菌株。3、本專利技術通過紫外線誘變和青霉素處理，得到了后酸能力弱化的嗜熱鏈球菌。基礎配料下，弱后酸化菌株發酵產品25℃存儲21d的后酸可以控制在95°T以內。附圖說明下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細的說明。圖1為紫外線-青霉素篩選弱后酸菌株流程圖；圖2為硫酸新霉素篩選弱后酸菌株原理圖；圖3為實施例1部分弱后酸單株的pH變化曲線；圖4為弱后酸菌株25℃存儲的后酸；圖中左為紫外-青霉素處理，右為紫外-新霉素處理；圖5為紫外-青霉素處理弱后酸菌株25℃的后酸遺傳穩定性。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都涉及本專利技術保護的范圍。實施例1(1)制備菌懸液：挑取單菌落(出發菌株)于M17培養基37℃培養16h；3％接種量轉接至新鮮M17，42℃培養4h，離心，洗滌2次，濃縮(2.67倍)于空平皿中，備用，所述M17培養基包括如下組分：大豆蛋白胨5g、酵母提取物5g、聚蛋白胨5g、抗壞血酸0.5g、牛肉浸膏2.5g、β-甘油磷酸二鈉19g、瓊脂15g、硫酸鎂0.5ml、蒸餾水1L，pH7.0，所述硫酸鎂為1.0mol/L硫酸鎂水溶液；(2)紫外照射：紫外誘變儀提前預熱30min，將懸液在紫外燈下照射5s(致死率為95％)；(3)復壯培養：將菌體重懸于新鮮M17培養基，42℃培養至pH下降至4.4；(4)青霉素處理：添加10ug/mL青霉素42℃處理1h(致死率50％)，稀釋涂板(MC培養基)，37℃培養；所述MC培養基大豆蛋白胨5g、牛肉浸粉3g、酵母浸粉3g、葡萄糖20g、乳糖20g、碳酸鈣10g、瓊脂15g、蒸餾水1L，pH5.9。對比例1將實施例1中青霉素替換為硫酸新霉素(簡稱新霉素)，其他操作與實施例1的操作相同。專利技術人在實驗時，曾設想能否用其他抗生素代替青霉素，以新霉素為例。低pH條件下，細胞質膜中的質子泵(H+-ATPase)是維持細胞正常生長代謝的關鍵酶，篩選H+-ATPase缺陷的乳酸菌突變株是弱后酸化的常用手段。新霉素的攝入需要消耗能量，當H+-ATPase活力降低時，細胞因供能不足而無法攝入新霉素，從而對新霉素產生抗性。因此，可以利用新霉素作為篩選壓力，篩選嗜熱鏈球菌的弱后酸的自發突變株，對新霉素進行了實驗探究，新霉素的作用原理如圖2所示。弱后酸化菌株的篩選：(1)在超凈臺日光燈下，標記MC培養基中數量百分比為10％以內的較小的單菌落，用接種環挑取至培養基中37℃培養15h；(2)將上述菌液接種于基礎配料(94％奶+6％糖)中，插入pH電極，42℃發酵20h，挑選發酵前期pH與出發菌株下降一致，而后期下降緩慢的菌株，實施例1的部分2弱后酸單株的pH變化曲線如圖3所示。經上述紫外誘變和青霉素處理(實施例1)，獲得一株弱后酸化菌株，命名為Q16-6#；經紫外誘變和新霉素處理(對比例1)，獲得一株弱后酸化菌株，命名為X6-1#。弱后酸菌株發酵特性的驗證：工藝路線：采用94％奶+6％糖，作為基礎配料，于60℃化料15min，20MPa均質，95℃滅菌5min，接種，42℃發酵至70°T終止，破乳，后熟(4℃冷藏12本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：/nS1、制備菌懸液：將出發菌株培養得菌液，轉接繼續培養至對數中期，離心、洗滌、濃縮，得懸液置于空平皿中備用；/nS2、紫外照射：將所述懸液置于紫外燈下照射；/nS3、復壯培養：將S2所得菌體重懸于新鮮培養基復壯培養；/nS4、青霉素處理：添加青霉素處理，稀釋，涂布于MC培養基培養；/nS5、篩選弱后酸化菌株。/n

【技術特征摘要】
1.一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1、制備菌懸液：將出發菌株培養得菌液，轉接繼續培養至對數中期，離心、洗滌、濃縮，得懸液置于空平皿中備用；
S2、紫外照射：將所述懸液置于紫外燈下照射；
S3、復壯培養：將S2所得菌體重懸于新鮮培養基復壯培養；
S4、青霉素處理：添加青霉素處理，稀釋，涂布于MC培養基培養；
S5、篩選弱后酸化菌株。


2.根據權利要求1所述的一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，所述步驟S1的具體操作為：將出發菌株在M17培養基37℃培養12～18h，轉接至新鮮M17培養基，42℃培養至對數中期，離心，洗滌，濃縮得懸液。


3.根據權利要求1所述的一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，所述步驟S2的具體操作為：紫外誘變儀提前預熱，將所述懸液在紫外燈下照射使得致死率>90％。


4.根據權利要求1所述的一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，所述步驟S3的具體操作為：將S2所得菌體重懸于M17培養基，42℃培養至pH為4.4～4.5。


5.根據權利要求1所述的一種選育弱后酸化嗜熱鏈球菌菌株的方法，其特征在于，所述步驟S4的具體操作為：添加8～10ug/mL青霉素42℃處理0.5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張彥偉，楊玲，仵紅巖，趙林森，賈洪利，孫策，齊世華，路江浩，劉佳，申朋，
申請(專利權)人：河北一然生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：河北;13