調控的基因編輯系統技術方案

本發明專利技術提供了一種具有降低的脫靶效應的基因編輯系統，包括(a)包含編碼核酸酶的核酸序列的載體，其中編碼核酸酶的核酸在其序列內包含調控核酸序列，該調控核酸序列具有定義第一內含子和第二內含子的第一組剪接元件和第二組剪接元件，其中第一內含子和第二內含子在編碼包含符合讀框的終止密碼子序列的非天然存在的外顯子序列的序列的側翼，并且其中第一內含子和第二內含子從mRNA信息中被剪接以產生編碼無功能核酸酶的mRNA，該無功能核酸酶包含由非天然存在的外顯子編碼的氨基酸序列；和(b)結合調控序列的寡核苷酸。還提供了使用本發明專利技術的基因編輯系統調控轉基因表達的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】調控的基因編輯系統優先權聲明本申請根據35U.S.C.§119(e)要求于2018年10月9日提交的美國臨時申請第62/743,317號和于2019年7月3日提交的美國臨時申請第62/870,427號的權益，其全部內容通過引用以其整體并入本文。有關序列表的電子遞交的聲明根據37C.F.R.§1.821提交了ASCII文本格式的序列表，命名為5470-858WO_ST25.txt，大小為371,885字節，于2019年10月8日生成并通過EFS-Web遞交，代替紙質副本。特此將該序列表以引用的方式并入本文的說明書中作為其公開內容。
本專利技術涉及用于調控基因編輯的組合物及其使用方法。專利技術背景基因組測序技術和分析方法的最新進展已經顯著加速了對與多種生物學功能和疾病有關的遺傳因子進行分類和映射作圖的能力。精確靶向基因組的能力將通過允許個別遺傳元件的選擇性改變來允許因果遺傳變異的反向工程化，并促進合成生物學、生物技術和醫學應用。盡管已經在基因組編輯技術方面取得了進展，但是已經發現，在基因編輯期間可能發生大量脫靶(例如，意外的突變)，這限制了該方法作為治療方案。因此，需要一種針對其靶標具有更高的特異性和可靠性的更精確的基因組編輯系統。內源基因表達在幾個轉錄后水平上被進一步調控，這些水平可能是探索外源基因表達的更精確控制的領域。例如，RNA的產生受轉錄速率控制，但功能性RNA需要正確剪接，然后才能產生正確的基因產物。通過調控轉基因RNA的剪接，可以控制基因產物的產生。本專利技術提供了用于在細胞中精確控制基因組編輯系統的表達的組合物和方法，從而降低了脫靶效應并增加其特異性。
技術實現思路
本專利技術提供了一種具有降低的脫靶效應的用于編輯基因(例如，改變至少一種基因產物的表達)的系統，包括向具有你想要改變的基因序列(例如，靶基因序列)的細胞中導入：a)包含編碼核酸酶的核酸序列的載體(例如，病毒或非病毒載體、rAAV等)，其中編碼核酸酶的核酸在其編碼序列內包含調控核酸序列，該調控核酸序列具有定義第一內含子和第二內含子的第一組剪接元件和第二組剪接元件，其中第一內含子和第二內含子在編碼包含符合讀框的終止密碼子序列的非天然存在的外顯子序列的序列的側翼，并且其中當第一內含子和第二內含子從前體mRNA信息中被剪接時，產生編碼無功能核酸酶的mRNA，該無功能核酸酶包含由非天然存在的外顯子編碼的氨基酸序列；和b)結合所述調控序列的寡核苷酸，其中在細胞內，所述寡核苷酸阻止第二組剪接元件從mRNA被剪接，從而產生缺少所述外顯子并編碼對靶基因的基因編輯起作用的核酸酶的mRNA。在一個實施方案中，該系統還包含能夠結合靶基因序列的gRNA。在此方面的一個實施方案中，核酸酶是CRISPR相關的核酸酶、大范圍核酸酶、鋅指核酸酶或轉錄激活因子樣效應物核酸酶。在此方面的一個實施方案中，核酸酶是核酸內切酶或核酸外切酶。可以使用本文所述的系統和方法調控任何基因。例如，在一個實施方案中，待調控的基因是選自由以下組成的組的疾病或病癥的疾病相關基因：肌萎縮性側索硬化癥；內毒素血癥；動脈粥樣硬化性血管疾病，即冠狀動脈疾病；支架再狹窄；頸動脈代謝性疾病；中風；急性心肌梗死；心力衰竭；外周動脈疾病；肢體缺血；靜脈移植失敗；AV內瘺失敗(AVfistulafailure)；克羅恩病；潰瘍性結腸炎；回腸炎和腸炎；陰道炎；銀屑病和炎癥性皮膚病如皮炎；濕疹；特應性皮炎；過敏性接觸性皮炎；蕁麻疹；血管炎；脊柱關節病(spondyloarthropathies)；硬皮病；呼吸道過敏性疾病如哮喘；過敏性鼻炎；超敏性肺病；關節炎(例如，類風濕性關節炎和銀屑病性關節炎)；濕疹；牛皮癬；骨關節炎；多發性硬化；系統性紅斑狼瘡；糖尿病；腎小球腎炎；移植排斥(包括同種異體移植排斥和移植物抗宿主病)或工程化組織的排斥；傳染病；肌炎；炎性CNS病癥；中風；閉合性腦損傷(closed-headinjuries)；神經退行性疾病；阿爾茨海默病；腦炎；腦膜炎；骨質疏松；痛風；肝炎；肝靜脈閉塞病(VOD)；出血性膀胱炎；腎炎；膿毒癥；結節病；結膜炎；耳炎；慢性阻塞性肺病；鼻竇炎；貝赫切特綜合征；移植物抗腫瘤效應；粘膜炎；闌尾炎；闌尾破裂；腹膜炎；主動脈瓣疾病；二尖瓣疾病；雷特綜合征；結節性硬化癥；苯丙酮尿癥；斯-李-奧(Smith-Lemli-Opitz)綜合征和脆性X綜合征；帕金森病；Aicardi-Goutières綜合征；亞歷山大病；Allan-Hemdon-Dudley綜合征；POLG相關病癥；α-甘露糖苷貯積癥(II型和III型)；綜合征；天使人綜合征；共濟失調-毛細血管擴張；神經元蠟樣脂褐質沉積癥；β地中海貧血；雙側視神經萎縮和(嬰兒)視神經萎縮1型；視網膜母細胞瘤(雙側)；卡納萬病(CanavanDisease)；腦-眼-面-骨骼綜合征1[COFS1]；腦腱性黃瘤癥；德朗熱綜合征(CorneliadeLangeSyndrome)；MAPT相關病癥；遺傳性朊病毒病；Dravet綜合征；早發性家族性阿爾茨海默病；弗里德賴希共濟失調[FRDA]；弗萊斯綜合征；巖藻糖苷貯積癥；福山型先天性肌營養不良癥；半乳糖唾液酸貯積癥；高歇氏病；有機酸血癥；噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥；早年衰老綜合癥(Hutchinson-GilfordProgeriaSyndrome)；粘多糖癥II；嬰幼兒游離唾液酸貯積病(InfantileFreeSialicAcidStorageDisease)；PLA2G6相關神經退行性病變；珍維-蘭格-尼爾遜(Jervell-Lange-Nielsen)綜合征；交界性大皰性表皮松解癥(JunctionalEpidermolysisBullosa)；亨廷頓病；克拉伯病(嬰幼兒型)；線粒體DNA相關的雷氏綜合征(Leighsyndrome)和NARP；Lesch-Nyhan綜合征；LIS1相關性無腦回畸形；勒韋(Lowe)綜合征；楓糖尿癥；MECP2重復綜合征；ATP7A相關的銅轉運障礙；LAMA2相關肌營養不良；芳基硫酸酯酶A缺乏癥；粘多糖病I型、II型或III型；過氧化物酶體生物發生障礙(PeroxisomeBiogenesisDisorder)；澤爾韋格綜合征譜；神經退行性疾病伴腦鐵沉積癥；酸性鞘磷脂酶缺乏癥；尼曼匹克癥C型；甘氨酸腦病；ARX相關病癥；尿素循環障礙；COL1A1/2相關的成骨不全癥；線粒體DNA缺失綜合征；PLP1相關病癥；佩里綜合征；Phelan-McDermid綜合征；糖原貯積病II型(龐貝病)(嬰幼兒型)；MAPT相關病癥；MECP2相關病癥；肢根斑點狀軟骨發育不良1型；羅伯特綜合征；山德霍夫(Sandhoff)病；Schindler病1型；腺苷脫氨酶缺乏癥；斯-李-奧綜合征；脊髓性肌萎縮；嬰幼兒發作性脊髓小腦性共濟失調；氨基己糖苷酶A缺乏癥；致死性發育不良1型；VI型膠原相關病癥；Usher綜合征I型；先天性肌營養不良癥；Wolf-Hirschhorn綜合征；溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥；和著色性干皮病。在一個實施方案中，被調控的基因是與周圍本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種具有降低的脫靶效應的用于編輯基因(例如，改變至少一種基因產物的表達)的系統，包括向具有靶基因序列的細胞中導入：/na)包含編碼核酸酶的核酸序列的載體，其中編碼所述核酸酶的所述核酸在其序列內包含調控核酸序列，所述調控核酸序列具有定義第一內含子和第二內含子的第一組剪接元件和第二組剪接元件，其中所述第一內含子和第二內含子在編碼包含符合讀框的終止密碼子序列的非天然存在的外顯子序列的序列的側翼，并且其中所述第一內含子和第二內含子從前體mRNA信息中被剪接以產生編碼無功能核酸酶的mRNA，所述無功能核酸酶包含由非天然存在的外顯子編碼的氨基酸序列；和/nb)結合所述調控核酸序列的寡核苷酸，/n其中在所述細胞內，所述寡核苷酸阻止所述第二組剪接元件從所述mRNA被剪接，從而產生缺少所述外顯子并編碼對靶基因的基因編輯起作用的核酸酶的mRNA。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20181009 US 62/743,317;20190703 US 62/870,4271.一種具有降低的脫靶效應的用于編輯基因(例如，改變至少一種基因產物的表達)的系統，包括向具有靶基因序列的細胞中導入：
a)包含編碼核酸酶的核酸序列的載體，其中編碼所述核酸酶的所述核酸在其序列內包含調控核酸序列，所述調控核酸序列具有定義第一內含子和第二內含子的第一組剪接元件和第二組剪接元件，其中所述第一內含子和第二內含子在編碼包含符合讀框的終止密碼子序列的非天然存在的外顯子序列的序列的側翼，并且其中所述第一內含子和第二內含子從前體mRNA信息中被剪接以產生編碼無功能核酸酶的mRNA，所述無功能核酸酶包含由非天然存在的外顯子編碼的氨基酸序列；和
b)結合所述調控核酸序列的寡核苷酸，
其中在所述細胞內，所述寡核苷酸阻止所述第二組剪接元件從所述mRNA被剪接，從而產生缺少所述外顯子并編碼對靶基因的基因編輯起作用的核酸酶的mRNA。


2.根據權利要求1所述的系統，其中所述核酸酶選自由以下組成的組：CRISPR相關的核酸酶、大范圍核酸酶、鋅指核酸酶和轉錄激活因子樣效應物核酸酶。


3.根據權利要求1所述的系統，其中所述核酸酶是核酸內切酶或核酸外切酶。


4.根據權利要求1所述的系統，其中組分(a)還包含結合所述靶基因序列的gRNA。


5.根據權利要求1所述的系統，其中所述調控核酸序列是β珠蛋白突變型內含子。


6.根據權利要求1所述的系統，其包含至少兩種調控核酸序列。


7.根據權利要求1所述的系統，其中所述調控核酸序列包含選自由以下組成的組的序列：SEQIDNO:18(IVS2-654內含子C-T)、SEQIDNO:50(具有564CT突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:51(具有657G突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:52(具有658T突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:20(具有657GT突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:53(具有200bp缺失的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:68(僅具有197bp的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:55(具有6A突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:56(具有564C突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:57(具有841A突變的IVS2-654內含子)、SEQIDNO:59(具有564CT突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:60(具有657G突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:61(具有658T突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:62(具有657GT突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:63(具有200bp缺失的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:64(具有425bp缺失的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:65(具有6A突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:66(具有564C突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:67(具有841A突變的IVS2-705內含子)、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:143、SEQIDNO:144、SEQIDNO:145、SEQIDNO:146、SEQIDNO:147、SEQIDNO:148，及其任何組合，包括單個序列。


8.根據權利要求1所述的系統，其中結合所述調控序列的所述寡核苷酸包含選自由以下組成的組的序列：SEQIDNO:37(針對IVS2-654CT的寡核苷酸)、SEQIDNO:38(針對具有657GT突變的IVS2-654的寡核苷酸)、SEQIDNO:39(針對IVS2-654中6A突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:40(針對IVS2-654中564C突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:41(針對IVS2-654中564CT突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:43(針對IVS2-654中841A突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:44(針對IVS2-654中657G突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:45(針對IVS2-654中658T突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:42(針對IVS2-705中705G突變的寡核苷酸)、SEQIDNO:49(針對IVS2-705的寡核苷酸)、SEQIDNO:76(誘導反義外顯子23跳躍的寡核苷酸)以及SEQIDNO138(針對LUC-AON1的寡核苷酸)、SEQIDNO:139(針對LUC-AON2的寡核苷酸)、SEQIDNO:140(針對LUC-AON3的寡核苷酸)、SEQIDNO:141(針對LUC-AON4的寡核苷酸)、SEQIDNO:142(針對IVS2(S0)-654,LUC-65...

【專利技術屬性】
技術研發人員：理查·J·薩謬斯基，
申請(專利權)人：北卡羅來納大學查佩爾希爾分校，
類型：發明
國別省市：美國;US