正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途制造技術

本發明專利技術屬中藥黃芪促生技術領域，為了解決目前黃芪資源綠色、持續發展問題，提供正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，100 mmol/L正己醇水溶液無菌濾膜過濾除菌后，4℃保存即為正己醇誘導因子；按體積比0.5‰的添加量，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，按質量體積比10%的接種量接種黃芪根培養物，25℃、100 rpm搖床培養1?2周。正己醇具有促進毛蕊異黃酮葡萄糖苷合成前體合成的作用。綜合考慮不定根產量和活性成分合成積累的雙重促進作用，誘導子正己醇有望開發為一種綠色添加劑，應用于蒙古黃芪不定根組織培養體系，提高根培養物產量和活性物質含量。

【技術實現步驟摘要】
正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途
本專利技術屬于中藥黃芪促生
，具體涉及正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途。通過培養介質中添加低濃度正己醇，促進了黃芪不定根組織培養物生物量的增加，以及培養物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和黃芪皂苷IV的合成積累。
技術介紹
黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，屬常用補益類藥材，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血等功效。黃芪首載入1963年版《中華人民共和國藥典》，之后收載于歷版。已有研究表明，黃芪含有三萜皂苷、異黃酮、多糖、氨基酸等多種活性成分。迄今為止，研究者已從黃芪中分離鑒定得200多種化合物。其中，黃芪皂苷Ⅳ和毛蕊異黃酮葡萄糖苷不僅是黃芪藥材中含有的主要活性成分，也是黃芪的質控指標成分。《中華人民共和國藥典》（2020版）規定，黃芪藥材中黃芪甲苷Ⅳ含量不得低于0.08%（0.08mg/g，干重），毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量不得低于0.02%（0.02mg/g）。2019年11月，國家衛健委、國家市場監督管理總局聯合發布《關于對黨參等9種物質開展按照既是食品又是中藥材的物質管理試點工作的通知》，新增黃芪為藥食同源中藥材品種。2020年12月2日，歐盟委員會發布法規2020/1821號條例，批準黃芪提取物作為新型食品投放市場，名稱為“黃芪提取物”。黃芪藥材，目前以仿野生栽培和平地移栽品為主，仿野生栽培黃芪的生長年限≥4年，平地移栽黃芪生長年限≥2年，生長周期較長；田間管理噴施化學合成農藥防治病蟲害、根施化學肥料促進生長，不僅容易造成黃芪藥材農藥殘留、藥材品質下降，同時也會引起土壤污染、板結和肥力下降等，不利于有限土地資源的循環利用。運用植物組織培養學方法，挖掘新的藥用黃芪資源獲得途徑，是制備黃芪提取物、保障黃芪產業綠色發展、可持續利用的一種積極、經濟、高效補給途徑。相比于藥用黃芪田間栽培至少2年的生長周期，黃芪根培養物具有生長周期短、無農藥和化肥污染、不占用土地資源等優點，是短期內獲取大量藥用黃芪、制備黃芪提取物的重要原料。與發根農桿菌誘導生成的毛狀根培養物含有有毒的冠癭堿、后期提取物制備成本高相比，不定根培養物更為安全、經濟，具有很好的產業發展前景。兼具黃芪不定根生長和活性成分合成積累促進作用的誘導子將有助于黃芪不定根培養體系的產業化和成本節約。正己醇是植物中的一種常見綠葉揮發物，存在于黃芪根部。現有針對煙草、擬南芥等植物的研究發現，正己醇具有介導植物化學防御應答的作用，但在藥用植物非揮發性活性成分合成積累中的作用未見報道，相關的應用研究尚未涉及。
技術實現思路
本專利技術為了解決目前黃芪資源綠色、持續發展問題，提供了正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，正己醇提高了黃芪不定根產量和根中活性成分黃芪皂苷Ⅳ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷的含量。本專利技術由以下技術方案實現的：正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，所述正己醇處理方法為：100mmol/L正己醇水溶液無菌濾膜過濾除菌后，4℃保存即為正己醇誘導因子；具體應用方法為：按照體積比為0.5‰的添加量，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，再按照質量體積比為10%的接種量接種黃芪根培養物，25℃、100rpm搖床培養1-6周。本專利技術提供了所述正己醇誘導因子在誘導黃芪不定根生長中的用途。進一步的，所述正己醇在黃芪不定根組織培養體系中的用途，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，接種黃芪根培養物，搖床培養2周。本專利技術還提供了所述正己醇在誘導黃芪多活性成分合成積累中的用途，所述多活性成分為毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，接種黃芪根培養物，搖床培養2周。所述正己醇在誘導黃芪多活性成分合成積累中的用途，所述多活性成分為黃芪皂苷Ⅳ，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，接種黃芪根培養物，搖床培養1周。所述黃芪不定根液體培養基為：含1mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖的1/2MS液體培養液。所述黃芪為蒙古黃芪。本專利技術所述正己醇通過商業購買的方式獲得分析純試劑，母液配制用水為滅菌后的去離子水。本專利技術所述的正己醇誘導因子適用于蒙古黃芪不定根組織培養體系，在無菌震蕩搖床培養條件提高不定根產量和多種活性成分含量的作用。本專利技術所述正己醇天然存在于藥用植物黃芪根中，在道地黃芪即渾源黃芪中含量高，屬揮發性有機化合物，與水互溶性佳，應用于黃芪不定根培養體系，不存在二次污染問題；正己醇誘導因子促進蒙古黃芪不定根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷合成積累，與抑制其合成前體物質的合成、促進合成前體即毛蕊異黃酮和芒柄花黃素的糖基化及隨后的酰基化修飾有關。在黃芪不定根培養5-6周時，正己醇具有促進毛蕊異黃酮葡萄糖苷合成前體-芒柄花黃素合成的作用。因此，正己醇將為蒙古黃芪不定根培養體系提供了一種綠色、效應持久的環境友好型化學誘導劑。本專利技術所確定的化學誘導因子-正己醇，除存在于黃芪外，還存在于其他多種中藥材中，如柴胡揮發油中，正己醇所占比例高達6.216%[1]；興安白芷揮發油中，正己醇所占比例為0.33%[2]；鴉膽子揮發油中，正己醇所占比例為3.13%[3]；牛蒡子揮發油中，正己醇所占比例為0.52%[4]。化學誘導因子正己醇很可能在上述藥用植物組織培養物中發揮有益作用。本專利技術涉及的化學誘導因子，通過如下途徑篩選獲得。首先添加1‰體積的50mmol/L正己醇、E-2-己烯醛、正己醛于1/2MS培養液中，搖床振搖培養2周，動態取樣。通過分析上述處理及對照樣本中黃芪皂苷Ⅳ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷含量和培養2周時的生物量，發現正己醇同時具有促進蒙古黃芪不定根生長、根中上述活性成分合成積累的作用。在此基礎上，開展第二輪正己醇處理實驗，相同條件下，培養6周，從轉錄和代謝調節層面，對正己醇促進作用機制進行了闡釋。發現在培養6周時，正己醇處理組毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷共有的合成前體-芒柄花黃素合成量遠高于對照；培養5周時，正己醇處理組參與毛蕊異黃酮葡萄糖苷合成前體合成的IFS1.1（毛蕊異黃酮合成酶1.1）表達顯著上調。提示在處理5-6周時，正己醇具有促進毛蕊異黃酮葡萄糖苷合成前體合成的作用。綜合考慮不定根產量和活性成分合成積累的雙重促進作用，誘導子正己醇有望開發為一種綠色添加劑，應用于蒙古黃芪不定根組織培養體系，提高根培養物產量和活性物質含量。附圖說明圖1為黃芪苗及誘導生成的黃芪不定根及其液體培養物（A、B、C、D、E）；圖中，A為黃芪組培苗及不定根誘導用頂芽（箭頭標示）；B為誘導形成的不定根早期形態（箭頭標示）；C為液體培養用不定根；D為繼代培養用黃芪不定根培養物；E為用于正己醇等處理用黃芪不本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，其特征在于：所述正己醇處理方法為：100 mmol/L正己醇水溶液無菌濾膜過濾除菌后，4℃保存即為正己醇誘導因子；/n具體應用方法為：按照體積比為0.5‰的添加量，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，再按照質量體積比為10%的接種量接種黃芪根培養物，25℃、100 rpm搖床培養1-6周。/n

【技術特征摘要】
1.正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，其特征在于：所述正己醇處理方法為：100mmol/L正己醇水溶液無菌濾膜過濾除菌后，4℃保存即為正己醇誘導因子；
具體應用方法為：按照體積比為0.5‰的添加量，添加正己醇誘導因子于黃芪不定根液體培養基中，再按照質量體積比為10%的接種量接種黃芪根培養物，25℃、100rpm搖床培養1-6周。


2.根據權利要求1所述的正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，其特征在于：所述正己醇誘導因子在誘導黃芪不定根生長中的用途。


3.根據權利要求2所述的正己醇在誘導黃芪不定根生長以及黃芪多活性成分合成積累中的用途，其特征在于：所述正己醇在黃芪不定根組織培養體系中的用途，添加正己醇誘導因子的于黃芪不定根液體培養基中，接種黃芪根培養物，搖床培養2周。


4.根據權利要求1所述的正己醇在誘導黃芪不...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫海峰，盛劍，張晴晴，左心雨，張春芬，高建平，曹秋芬，
申請(專利權)人：山西大學，
類型：發明
國別省市：山西;14