本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及用于表達(dá)Kir7.1的基因治療構(gòu)建體和藥物組合物。這些基因治療構(gòu)建體包含載體，所述載體包含與編碼Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子。還提供了對(duì)患有與Kir7.1多肽的表達(dá)或功能不足相關(guān)聯(lián)的病癥的受試者進(jìn)行治療的方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】KIR7.1基因治療載體及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2018年10月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第62/743,623號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明本專(zhuān)利技術(shù)是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的EY024995的政府支持下完成的。美國(guó)政府擁有本專(zhuān)利技術(shù)的某些權(quán)利。序列表名為“960296_03962_ST25.txt”的序列表的ASCII文本文件的內(nèi)容(其大小為34.2kb)是于2019年10月9日創(chuàng)建并經(jīng)由EFS-Web以電子方式提交，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。
技術(shù)介紹
萊伯氏先天性黑矇(LCA)是以出生時(shí)視力嚴(yán)重喪失為特征的遺傳性?xún)嚎菩问降氖鳌；加蠰CA的兒童還會(huì)顯示多種其他異常，包括飄忽眼動(dòng)(眼球震顫)、眼睛深陷、對(duì)強(qiáng)光敏感、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常。通常，在嬰兒出生后的頭幾個(gè)月內(nèi)，父母注意到缺乏視覺(jué)反應(yīng)和眼球震顫。盡管患有LCA的嬰兒的視網(wǎng)膜看起來(lái)正常，但通過(guò)視網(wǎng)膜電圖(ERG)在視網(wǎng)膜中檢測(cè)到很少(如果有的話(huà))的活動(dòng)。然而，在青春期的早期會(huì)檢測(cè)到視網(wǎng)膜外觀的各種變化，包括視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中的色素變化和血管收縮的存在。LCA通常以常染色體隱性遺傳的方式在家族中傳遞。在外部視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中表達(dá)的至少21個(gè)基因中的突變與LCA有關(guān)。在過(guò)去的十年中，已在患有特定形式LCA(稱(chēng)為L(zhǎng)CA16)的患者中鑒定出了人KCNJ13基因中的常染色體隱性遺傳突變(在染色體基因座2q37.1上的603203)。迄今為止，LCA16致病性等位基因變異體包括：c.158G>A(p.Trp53Ter)、c.359T>C(p.Iso120Thr)、c.458C>T(p.Thr153Iso)、c.496C>T(p.Arg166Ter)和c.722T>C(p.Leu241Pro)。另外，已知復(fù)合雜合KCNJ13突變c.314G>T(p.Ser105Iso)和c.655C>T(p.G219Ter)會(huì)導(dǎo)致LCA患者中的早發(fā)性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良5。常染色體顯性KCNJ13突變c.484C>T(p.Arg162Trp)導(dǎo)致稱(chēng)為雪花玻璃體視網(wǎng)膜變性(SVDOMIM-193230)的早發(fā)性失明。人KCNJ13基因編碼向內(nèi)整流鉀通道-Kir7.1。Kir7.1蛋白在數(shù)個(gè)人體組織中被表達(dá)，包括RPE的細(xì)胞頂端過(guò)程(cellapicalprocess)，其中該過(guò)程調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的功能和健康。Kir7.1通道在其他器官中的作用仍有待闡明。盡管在如LCA16的疾病中正開(kāi)始了解Kir7.1的作用，但沒(méi)有經(jīng)批準(zhǔn)的療法用以治療與Kir7.1蛋白的表達(dá)或功能不足有關(guān)的通道病或疾病。因此，在本領(lǐng)域中需要用于治療這種疾病的新療法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
在本專(zhuān)利技術(shù)的一方面，提供了基因治療載體。基因治療載體可包含可操作地與編碼Kir7.1多肽的多核苷酸連接的啟動(dòng)子。在另一方面，本專(zhuān)利技術(shù)涉及治療組合物。這些治療組合物可包含本文中所述的任何基因治療載體、及藥學(xué)上可接受的載體。在本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)方面，提供對(duì)患有與Kir7.1多肽的表達(dá)或功能不足相關(guān)的疾病的受試者進(jìn)行治療的方法。所述方法可包括向受試者施用治療有效量的本文中所述基因治療載體中的任一種或者本文中所述治療組合物中的任一種。附圖說(shuō)明圖1A-圖1N示出了具有LCA16表型的患者來(lái)源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮。(圖1A)示出了具有正常TGG序列(SEQIDNO:19)的成熟視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的圖(明視場(chǎng)像)。表示樣本來(lái)源的家族譜。(圖1B)示出了來(lái)源于具有TAG序列的LCA16先證者的成熟視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的明視場(chǎng)像。(SEQIDNO:20)(圖1C)示出了無(wú)克隆性異常的患者樣本中的正常核型。(圖1D)示出了對(duì)來(lái)自對(duì)照LCA16和野生型人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮系和人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的Nhe1消化產(chǎn)物的分析。全長(zhǎng)Kir7.1序列的長(zhǎng)度為1083bp，經(jīng)消化產(chǎn)物的長(zhǎng)度為925和158bp。(圖1E)示出了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)。(圖1F)示出了代表性L(fǎng)CA16人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的電子顯微照片。(圖1G)示出了在10μm的細(xì)胞內(nèi)部的平均線(xiàn)粒體(Mit)計(jì)數(shù)的比較。(圖1H)示出了對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮頂端(AP)過(guò)程的平均長(zhǎng)度的評(píng)估。(圖1I)示出了在對(duì)照人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Kir7.1(紅色)、ZO-1(綠色)和DAPI(藍(lán)色)的免疫熒光定位。下方格和側(cè)方格兩者示出了有關(guān)于ZO-1和DAPI的Kir7.1的極化分布(z堆棧圖像)。(圖1J)示出了在LCA16人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮中的Kir7.1(紅色)、ZO-1(綠色)和DAPI(藍(lán)色)的定位。(圖1K)是蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，這些結(jié)果示出了在兩個(gè)組織樣本中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)。使用針對(duì)Kir7.1的C末端特異性抗體，我們?cè)趤?lái)自對(duì)照人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮的全細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到Kir7.1蛋白，但在LCA16人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮的全細(xì)胞裂解物中未檢測(cè)到Kir7.1蛋白。示出了在對(duì)照人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮(圖1L)和LCA16人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮(圖1M)樣本中的吞噬體(紅色)定位。(圖1N)示出了飼養(yǎng)4小時(shí)后和隨后的48小時(shí)消化期或者在飼養(yǎng)1天接著消化6天后，在對(duì)照和病變?nèi)苏T導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的固定的200μm2區(qū)域內(nèi)的平均吞噬體計(jì)數(shù)的圖。圖2A-圖2N示出了經(jīng)過(guò)無(wú)義突變抑制或基因擴(kuò)增的推定Kir7.1功能喪失緩解。(圖2A)示出了在對(duì)照人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮單元中使用正常外部K+(黑色)或高外部Rb+(淺藍(lán)色)的Kir7.1電流的平均電流-電壓(I/V)曲線(xiàn)圖。(圖2B)示出了在LCA16人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中使用正常K+(紅色)和高Rb+(淺藍(lán)色)的平均I/V曲線(xiàn)。(圖2C)示出了在-150mV處測(cè)量的向內(nèi)電流幅值的平均圖。顏色表示如a和b中所示。(圖2D)示出了對(duì)照(黑色)細(xì)胞與去極化LCA16(紅色)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的平均膜電位的比較。(圖2E)示出了在用NB84處理之前(紅色)和之后(深藍(lán)色)的平均I/V關(guān)系。在Rb+中測(cè)量的電流被顯示為淺藍(lán)色跡線(xiàn)。對(duì)在-150mV處測(cè)量的平均內(nèi)向電流(圖2F)、和膜電位(圖2G)的評(píng)估，用以展示NB84的作用。(圖2H)示出了使用抗GFP抗體作為阱使GFP融合蛋白沉淀，并且銀染色顯示了全長(zhǎng)Kir7.1和W53X蛋白的經(jīng)純化組分帶。GFP對(duì)照樣本顯示較小的蛋白產(chǎn)物。(圖2I)細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析顯示了當(dāng)用GFP特異性抗體進(jìn)行探測(cè)時(shí)的各個(gè)條帶。在NB84處理后觀察到全長(zhǎng)蛋白產(chǎn)物的部分修復(fù)。(圖2J)示出了在表達(dá)人Kir7.1克隆的正常拷貝的GFP陽(yáng)性細(xì)胞中所測(cè)量的Kir7.1電流的平均本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基因治療載體，其包含與編碼Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子。/n
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】20181010 US 62/743,6231.一種基因治療載體，其包含與編碼Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因治療載體，其中所述Kir7.1多肽包含與SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的多肽。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子在受試者的眼睛的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中具有活性。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子是EF1a啟動(dòng)子或VMD2啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子是與SEQIDNO:3具有至少90％序列同一性的EF1a啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子是與SEQIDNO:4具有至少90％序列同一性的VMD2啟動(dòng)子。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述啟動(dòng)子和多核苷酸是在雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA中被編碼。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述基因治療載體是病毒載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因治療載體，其中所述病毒載體選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體和腺病毒載體所組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因治療載體，其中所述病毒載體是慢病毒載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基因治療載體，其中所述慢病毒載體還包含表5或表6所列出組分中的至少一種組分。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因治療載體，其中所述病毒載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基因治療載體，其中所述AAV載體還包含表2或表3中所列出組分中的至少一種組分。
15.根據(jù)權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述的基因治療載體，其中所述AAV載體是AAV2載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)所...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：B·帕特耐克，P·夏希，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：威斯康星校友研究基金會(huì)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó);US
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