用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭、新型磁珠及DOT-seq方法技術

本發明專利技術公開了一種用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭，所述接頭為U形接頭，接頭的中間是寡聚單鏈核苷酸，且被修飾，以連接到磁珠上，寡聚單鏈核苷酸的兩端分別帶有雙鏈Tn5識別序列，兩端Tn5識別序列后面分別連接illumina測序文庫結構的P5序列及P7序列。并公開了相應的新型磁珠及DOT?seq方法。本發明專利技術的DOT?seq使用了更加高效的磁珠偶聯轉座酶方法，能夠有效保證轉座酶二聚體中結合的接頭是異質性接頭，也能夠保證轉座酶在磁珠上的分布更加均勻化。DOT?seq具有耗時更短、文庫產量更高，對DNA質量和投入量要求更低和文庫均一性更好等優點，適用于各類DNA NGS建庫需求，尤其是低質量的病源DNA樣本。

【技術實現步驟摘要】
用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭、新型磁珠及DOT-seq方法
本專利技術涉及一種用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭、新型磁珠及DOT-seq方法，屬于生物

技術介紹
DNA二代測序是現代病理學檢測的主要手段，在疾病診斷、腫瘤篩查、病原鑒定和藥物靶標設計等領域具有重要的作用。常規的DNA二代建庫通常采用機械法或酶切法進行DNA片段化，再通過末端修復、接頭連接和文庫擴增一共四步完成DNA文庫的構建。但是這種方法存在片段大小不均一、耗時長、對不同來源DNA片段化效果差異大，片段化效率不可控等因素，對于復雜病原樣本經常會導致文庫構建失敗、產量低、均一性差等現象。隨著轉座酶的發現和改造，利用轉座酶Tn5進行文庫片段化和擴增的DNANGS建庫被研發出來并廣泛使用，這種技術相較于傳統的機械法和酶切法DNA建庫相比，具有耗時短、操作簡單的優勢，但是對模板投入量的精準性具有嚴格的要求。通常而言，傳統Tn5介導的DNA建庫對DNA投入量及其敏感，投入量稍高會導致文庫大片段嚴重，文庫產量降低；投入量稍低會導致文庫過小，產量降低。這些都是由于轉座酶Tn5片段化后產生的DNA片段彌散嚴重導致的。這極大地降低了Tn5介導DNA文庫構建的可操作性和應用范圍。，且轉座酶法建庫產生的文庫均一性要比傳統機械法和酶切法要差很多。近年來，磁珠偶聯轉座酶法DNA建庫技術被研發出來用于解決轉座酶法建庫帶來的模板投入量要求嚴格和DNA文庫均一性差等弊端，但是如何保證轉座酶在磁珠上偶聯均勻，且能夠有效組裝成轉座酶異質性二聚體，一直沒有有效的解決方案。這極大地限制了磁珠偶聯轉座酶法DNA建庫技術的發展和應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種新型磁珠偶聯轉座酶并用于DNA快速均一化建庫方法（原理如圖1），命名為DOT-seq(DualOn-beadTagmentationandsequencing)。DOT-seq使用了更加高效的磁珠偶聯轉座酶方法，能夠有效保證轉座酶二聚體中結合的接頭是異質性接頭。本專利技術采用的技術方案為：一種用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭，所述接頭為U形接頭，接頭的中間序列為寡聚單鏈核苷酸，且被修飾，以連接到磁珠上，寡聚單鏈核苷酸的兩端分別設有雙鏈Tn5識別序列，兩端Tn5識別序列后面分別連接illumina測序文庫結構的P5序列及P7序列。其中修飾位點通常位于寡聚單鏈核苷酸的1/3-2/3的區域，以保證兩端的Tn5識別序列能夠有充分的空間與Tn5結合，最優選的方案為寡聚單鏈核苷酸的中間位點。優選的，U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸被生物素修飾、氨基修飾或者Arcydite修飾。優選的，U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。優選的，所述U形接頭的序列為：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[IntNH2C6dT]T…TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，其中U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。優選的，所述U形接頭的序列為：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[IntBiotindT]T…TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，其中U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。本專利技術還公開了一種用于偶聯轉座酶的新型磁珠，包括磁珠，以及結合在磁珠上的上述的DNA接頭。優選的，所述磁珠為鏈霉親和素磁珠、羧基磁珠或者聚丙烯酰胺包被磁珠；當磁珠為鏈霉親和素磁珠，DNA接頭為生物素修飾；當磁珠為羧基磁珠，DNA接頭為氨基修飾；當磁珠為聚丙烯酰胺包被磁珠時，DNA接頭為Arcydite修飾。本專利技術還公開了一種DOT-seq方法，其步驟包括：（1）磁珠與退火的DNA接頭偶聯，獲得偶聯接頭的磁珠，其中接頭為上述的DNA接頭；（2）步驟（1）獲得偶聯接頭的磁珠與轉座酶Tn5孵育結合，得到轉座酶偶聯磁珠復合物；（3）步驟（2）獲得的轉座酶偶聯磁珠復合物與DNA樣本結合并片段化；（4）終止轉座酶的片段化反應，進行文庫擴增，DNA回收。優選的，當步驟（1）中的磁珠為羧基磁珠，DNA接頭為氨基修飾時，步驟（1）中加入激活劑以完成偶聯，激活劑為嗎啉乙磺酸(MES)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)中的一種或數種。優選的，步驟（3）中還加入增強劑，所述增強劑為聚乙二醇、聚蔗糖、聚丙二醇、聚乙烯亞胺中的一種或數種。本專利技術的有益效果：本專利技術的DOT-seq使用了更加高效的磁珠偶聯轉座酶方法，能夠有效保證轉座酶二聚體中結合的接頭是異質性接頭，也能夠保證轉座酶在磁珠上的分布更加均勻化。因此，相較于傳統的磁珠偶聯轉座酶法DNA建庫，DOT-seq具有耗時更短、文庫產量更高，對DNA質量和投入量要求更低（50pg-1μg）和文庫均一性更好等優點，適用于各類DNANGS建庫需求，尤其是低質量的病源DNA樣本。附圖說明圖1、DOT-seq原理示意圖。圖2、鏈霉親和素磁珠偶聯生物素修飾接頭和羧基磁珠偶聯氨基接頭原理示意圖。圖3、鏈霉親和素磁珠偶聯轉座酶和羧基磁珠偶聯轉座酶在文庫產量上的比較。圖4、U形接頭和線形接頭偶聯磁珠示意圖。圖5、U形接頭和線形接頭介導的Tn5偶聯磁珠在DNA文庫產量上的比較。圖6、U形接頭和線形接頭介導的Tn5偶聯磁珠在DNA文庫大小上的比較。圖7、氨基修飾和生物素修飾U形接頭偶聯磁珠原理示意圖。圖8、氨基修飾和生物素修飾U形接頭偶聯磁珠在DNA文庫產量上的比較。圖9、氨基修飾和生物素修飾U形接頭偶聯磁珠在DNA文庫大小上的比較。圖10、U形接頭不同長度雙鏈配對結構示意圖。圖11、不同長度雙鏈配對的U形接頭對文庫產量的影響。圖12、U形接頭不同退火條件對DNA文庫產量的影響。圖13、U形接頭中間不同寡聚核苷酸長度示意圖。圖14、U形接頭中間不同寡聚核苷酸長度對DNA文庫產量的影響。圖15、退火時U形接頭oligo投入量比對文庫產量的影響。圖16、EZ-Tn5投入量對DNA文庫產量的影響。圖17、EZ-Tn5投入量對DNA文庫大小的影響。圖18、片段化增強劑對DNA文庫產量的影響。圖19、片段化時間對DNA文庫產量的影響。圖20、片段化時間對DNA文庫大小的影響。圖21、三種片段化終止條件對DNA文庫產量的影響。圖22、DOT-seq與其他轉座酶介導DNA建庫技術的流程比較。圖23、DOT-seq與其他轉座酶介導DNA建庫技術在文庫產量的比較。圖24、DOT-seq與其他轉座酶介導DNA建庫技術在文庫大小的比較。圖25、DOT-seq與其他轉座酶介導本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭，所述接頭為U形接頭，接頭的中間序列為寡聚單鏈核苷酸，且被修飾，以連接到磁珠上，寡聚單鏈核苷酸的兩端分別帶有雙鏈Tn5識別序列， 兩端Tn5識別序列后面分別連接illumina測序文庫結構的P5序列及P7序列。/n

【技術特征摘要】
1.一種用于結合磁珠并偶聯轉座酶的DNA接頭，所述接頭為U形接頭，接頭的中間序列為寡聚單鏈核苷酸，且被修飾，以連接到磁珠上，寡聚單鏈核苷酸的兩端分別帶有雙鏈Tn5識別序列，兩端Tn5識別序列后面分別連接illumina測序文庫結構的P5序列及P7序列。


2.根據權利要求1所述的DNA接頭，其特征在于：U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸被生物素修飾、氨基修飾或者Arcydite修飾。


3.根據權利要求2所述的DNA接頭，其特征在于：U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。


4.根據權利要求1或2所述的DNA接頭，其特征在于：所述U形接頭的序列為：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[IntNH2C6dT]T…TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，其中U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。


5.根據權利要求1或2所述的DNA接頭，其特征在于：所述U形接頭的序列為：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[IntBiotindT]T…TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，其中U形接頭中間的寡聚單鏈核苷酸長度為8-32nt。


6.一種用于偶聯轉座酶的新型磁珠，包括磁珠，以及...

【專利技術屬性】
技術研發人員：江翱，陳晶晶，蘇杰，曹振，宋東亮，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31