工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽及其組合物、以及編碼工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽的多核苷酸。還提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)氨酶的方法。在一些實施方案中，工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽被優(yōu)化以在濕有機溶劑中在最小含水條件下提供改進的酶性質(zhì)。在最小含水條件下提供改進的酶性質(zhì)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽
[0001]本申請要求2019年1月15日提交的美國專利申請序列號62/792,518的優(yōu)先權(quán)，該美國專利申請為了所有目的在此通過引用以其整體并入。
專利

[0002]本公開內(nèi)容涉及可用于在工業(yè)過程條件下產(chǎn)生藥物和精細化學(xué)品胺化合物的工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽。
[0003]對序列表、表格或計算機程序的引用
[0004]序列表的正式副本作為ASCII格式的文本文件經(jīng)由EFS
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Web與說明書同時提交，文件名為“CX2
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183WO1_ST25.txt”，創(chuàng)建日期為2020年1月10日，且大小為1.72兆字節(jié)。經(jīng)由EFS
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Web提交的序列表為說明書的一部分并且通過引用以其整體并入本文。
[0005]背景
[0006]轉(zhuǎn)氨酶(E.C.2.6.1)催化氨基基團、一對電子和質(zhì)子從氨基供體化合物轉(zhuǎn)移至氨基受體化合物的酮基團。轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)可導(dǎo)致手性胺產(chǎn)物化合物的形成。如方案1中所示，氨基受體化合物(B)(其為期望的手性胺產(chǎn)物(D)的酮底物前體)在存在轉(zhuǎn)氨酶的情況下與氨基供體化合物(A)反應(yīng)。轉(zhuǎn)氨酶催化氨基供體化合物(A)的伯胺基團轉(zhuǎn)移至氨基受體化合物(B)的酮基團。轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)產(chǎn)生手性胺產(chǎn)物化合物(D)(假定R1與R2不同)以及具有酮基團的新的氨基受體副產(chǎn)物(或“羰基副產(chǎn)物”)化合物(C)。
[0007]方案1
[0008][0009]手性胺化合物作為中間體或合成子常被用在制藥、農(nóng)業(yè)化學(xué)和化學(xué)工業(yè)中，用于制備廣泛范圍的商業(yè)上期望的化合物，諸如頭孢菌素或吡咯烷衍生物。通常手性胺化合物的這些工業(yè)應(yīng)用涉及僅利用分子的一種特定的立體異構(gòu)體形式，例如只有(R)或(S)對映異構(gòu)體是生理學(xué)活性的。轉(zhuǎn)氨酶是高度立體選擇性的并且具有許多潛在的工業(yè)用途，用于合成光學(xué)純的手性胺化合物。
[0010]使用轉(zhuǎn)氨酶制備手性胺化合物的實例包括：氨基酸的對映異構(gòu)體富集(參見，例如Shin等人,2001,Biosci.Biotechnol.Biochem.65:1782
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1788；Iwasaki等人,2003,Biotech.Lett.25:1843
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1846；Iwasaki等人,2004,Appl.Microb.Biotech.69:499
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505，Yun等人,2004,Appl.Environ.Microbiol.70:2529
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2534；和Hwang等人,2004,Enzyme Microbiol.Technol.34:429
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426)；制備普瑞巴林的中間體和前體(例如，WO 2008/127646)；環(huán)巴胺類似物的酶促轉(zhuǎn)氨基作用(例如，WO2011/017551)；β
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氨基酸的立體特異性合成和對映異構(gòu)體富集(例如，WO2005/005633)；胺類的對映異構(gòu)體富集(例如，美國專利第US4,950,606號；美國專利第5,300,437號；和美國專利第5,169,780號)；氨基酸和衍生物的產(chǎn)生(例如，美國專利第5,316,943號；美國專利第4,518,692號；美國專利第4,826,766號；
美國專利第6,197,558號；和美國專利第4,600,692號)；以及在藥物化合物西他列汀、卡巴拉汀和維那卡蘭的產(chǎn)生中(參見，例如2012年10月23日授權(quán)的美國專利第8,293,507B2號；Savile等人,2010,“Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture,”Science 329(5989):305
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9；2011年12月22日公布的WO2011/159910；和2012年2月23日公布的WO2012/024104)。
[0011]具有催化方案1的反應(yīng)的能力的野生型轉(zhuǎn)氨酶已從多種微生物分離，所述多種微生物包括但不限于反消化產(chǎn)堿菌(Alcaligenes denitrificans)、支氣管敗血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、羊布魯式桿菌(Brucella melitensis)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、青紫色素桿菌(Chromobacterium violaceum)、Oceanicola granulosus HTCC2516、海洋桿菌屬(Oceanobacter)種RED65、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)種MED92、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、根瘤菌屬(Rhizobium)種(菌株NGR234)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumonia)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)(參見例如，Shin等人,2001,Biosci.Biotechnol,Biochem.65:1782
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1788)、和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)種KNK168(參見例如，Iwasaki等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2006,69:499
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505，美國專利第7,169,592號)。這些野生型轉(zhuǎn)氨酶基因以及編碼的多肽中的若干種已被測序，包括例如青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)(Genbank登錄號YP_002257813.1，GI:207739420)、類鼻疽桿菌(Burkholderia pseudomallei)1710b(Genbank登錄號ABA47738.1，GI:76578263)、百日咳博德特氏菌(Bordetella petrii)(Genbank登錄號AM902716.1，GI:163258032)、河流弧菌JS17(Genbank登錄號AEA39183.1，GI:327207066)和節(jié)桿菌屬種KNK168(GenBank登錄號BAK39753.1，GI:336088341)。EC 2.6.1.18和EC 2.6.1
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19類的至少兩種野生型轉(zhuǎn)氨酶已被結(jié)晶并結(jié)構(gòu)地表征(參見，例如Yonaha等人,1983,Agric.Biol.Chem.47(10):2257
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2265)。
[0012]已知轉(zhuǎn)氨酶具有(R)
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選擇性的或(S)
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選擇性的立體選擇性。例如，來自節(jié)桿菌屬種KNK168的野生型轉(zhuǎn)氨酶被認為是(R)
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選擇性的并從某些底物主要產(chǎn)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種工程化多肽，所述工程化多肽具有轉(zhuǎn)氨酶活性，所述工程化多肽包含與SEQ ID NO:2、6、332、518和/或656具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化多肽的多肽序列包含至少一個取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:808、2、6、332、518和/或656編號。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且其中所述工程化多肽的多肽序列在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：20、23、244、284和284/155，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:2編號。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且其中所述工程化多肽的多肽序列在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：5/35、9、9/20/23/24/134/244、9/20/23/101/244、9/20/24/101/244/249、9/23/24、9/23/24/29/244、9/23/24/101/262、9/23/24/244/262、9/23/29、9/24/244、9/24/244/262、9/24/249、9/45/89/93、9/79/101/244、9/82/89、9/89/246、9/89/271、9/93/142/246、9/101/244、9/110/302、9/244/249、9/244/262/264、9/246、9/262、15、15/16/18/20/89/93/160、15/24/26/89/93/160、15/35/273、15/218/273、15/249/273、16、17/25、17/25/41、17/25/160、17/160、18、18/26/246/273、18/146、18/146/168、18/146/262、18/168、18/168/244、18/168/262/324、18/244、18/244/246、18/244/246/284、18/244/248、18/244/262/273、18/244/273、18/262、18/273、20、20/23/24/55/134/244/262、20/23/134/244、20/24/89/197、20/33/160、20/324、22、22/102、22/160、23、23/25/55/321、23/25/102/142、23/102、23/321、24、25、25/33、25/104、25/160、25/321、26、26/273、29、29/89、32、33、35、35/215/218/249、35/218/249/273、35/221、40、40/168/208/244、40/244/248、41、41/102、42、45、46、50、55、56、71/102、74、79、82、82/244、89、89/93/156/324、89/93/321/324、90、93、93/324、95、98、101、101/160/244/249、102、104、106、111、114、117、119、134、134/244、134/262、139、140/266、142、142/321、145、146、146/244、146/273、156、160、160/215/216/218、160/273、168、168/244/273、179、186、186/200、197、203、207、208、208/246、215、215/216/249、216、216/273、218、218/249、218/313、234、236、244、244/248、244/248/284、244/273、246、246/248/273、248、249、249/273、256、262、264、265、266、271、273、284、301、316、320、321、324和329，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:6編號。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:332具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且其中所述工程化多肽在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：9/89/93/101/160、9/89/160、33、35、44、49、74、89、89/93/160/249、107、108、117、140、141、142、144、156、168、203、207、234、270、273、274、292、296、297、300、302、305、317、319、321、323、327和329，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:332編號。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:518具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且其中所述工程化多肽在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：35/273、46/273、111/159/273、159、159/273、174、199、273和287，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:518編號。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:332具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述工程化多肽與SEQ ID NO:332的工程化多肽相比在濕有機溶劑中具有增加的熱活性，并且其中所述工程化多肽在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：23/29/55、34、44、74、92、108、117、140、141、144、156、160、168、215、256、269、270、274、292、296、302、319、323和329，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:332編號。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:518具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述工程化多肽與SEQ ID NO:518的工程化多肽相比在濕有機溶劑中具有增加的熱活性，并且其中所述工程化多肽在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：34/74/92、35/273/323、39、46/273、48、55、74/92、126、133、138、150、160/215/329、178、199、207、273和292，其中所述多肽序列的氨基酸位置參考SEQ ID NO:518編號。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽序列與SEQ ID NO:656具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述工程化多肽與SEQ ID NO:656的工程化多肽相比在濕有機溶劑中具有增加的熱活性，并且其中所述工程化多肽在所述多肽序列中選自以下的一個或更多個位置處包含至少一個取代或取代集：18、35/39/55/138/150、35/39/55/150、35/39/126/150/273、35/39/133、35/39/133/150/273、35/39/150、35/39/150/273、35/133/178、35/138/150/273、35/150/273、35/178/273、3...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：約瓦娜，
申請(專利權(quán))人：科德克希思公司，
類型：發(fā)明
國別省市：