催化糖鏈延伸的糖基轉移酶突變體及其應用制造技術

本發明專利技術涉及負責糖鏈延伸的糖基轉移酶突變體的應用。本發明專利技術提供了糖基轉移酶突變體，其可以高效催化在四環三萜類化合物的C

【技術實現步驟摘要】
催化糖鏈延伸的糖基轉移酶突變體及其應用


[0001]本專利技術涉及生物技術和植物生物學領域，具體地，本專利技術涉及一組糖基轉移酶及其應用。

技術介紹

[0002]人參皂苷是從人參屬植物(如人參、三七和西洋參等)和絞股藍中分離到的皂苷的總稱，是一類三萜化合物。人參皂苷亦可以根據其分離的來源稱為人參皂苷，三七皂苷和絞股藍皂苷。人參皂苷是這些藥用植物中的主要生物活性成份。目前，已經分離出了約150種皂苷。從結構上來看，人參皂苷主要是皂苷元經過糖基化后形成的生物活性小分子。人參皂苷的皂苷元只有有限的幾種，主要是達瑪烷型四環三萜的原人參二醇和原人參三醇，以及齊墩果烷酸。皂苷元通過糖基化后，可以提高水溶性，改變其亞細胞定位，并產生出不同的生物活性。絕大部分原人參二醇型皂苷是在C3和/或C20位羥基進行糖基化修飾，而原人參三醇型皂苷是在C6和/或C20的羥基上進行糖基化修飾。不同類型的糖基以及不同程度的糖基化修飾產生了分子結構繁多的人參皂苷。
[0003]鼠李糖基化修飾的人參皂苷具有豐富的生物活性。例如Rg2是在Rh1的C6-O-Glc延伸一分子鼠李糖，Rg2在治療抑郁、改善心功能、提高學習記憶能力、抗老年癡呆等方面具有很好功效；人參皂苷Re是在Rg1的C6-O-Glc延伸一分子鼠李糖，可能通過促進腸道組織中胰高血糖素樣肽-1的分泌來發揮降血糖、治療糖尿病的作用。
[0004]人參皂苷以人參或者三七的總皂苷或者豐富皂苷為原料，依賴化學、酶和微生物發酵的水解方法進行制備。由于野生的人參資源已基本耗竭，人參皂苷資源目前來源于人參或三七的人工栽培，而其人工栽培的生長周期長(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，還經常受到病蟲害而需要施用大量的農藥，所以，人參或三七的人工栽培有嚴重的連作障礙(人參或三七種植地需要休耕5-15年以上才能克服連作障礙)，所以人參皂苷的產量、品質及安全性都面臨挑戰。
[0005]合成生物學的發展為植物來源的天然產物的異源合成提供了新的機遇。以酵母為底盤，通過代謝途徑的組裝和優化，已經實現了用廉價的單糖來發酵合成青蒿酸或者雙氫青蒿酸，繼而再通過一步化學轉化的方法生產青蒿素，這表明合成生物學在天然產物的藥物合成方面具有的巨大潛力。利用酵母底盤細胞通過合成生物學方法異源合成人參皂苷單體，原料為廉價的單糖，制備過程為安全性可調控的發酵過程，避免了任何外來污染(例如，原料植物人工種植時使用的農藥)。因此，通過合成生物學技術制備人參皂苷單體，不僅具有成本優勢，而且，可以保證成品的品質與安全性。利用合成生物學技術制備足夠量的各種高純度的天然與非天然的人參皂苷單體，用于活性測定及臨床實驗，促進稀有人參皂苷的創新藥物研發。
[0006]近年來通過對人參、三七和西洋參的轉錄組和功能基因組研究，人參皂苷皂苷元合成途徑的解析已經有了非常大的進展。2006年，日本和韓國科學家分別鑒定了將環氧角鯊烯轉化為達瑪烯二醇的萜環化酶元件(達瑪烯二醇合成酶，PgDDS)。2011年到2012年，韓
國科學家又鑒定了把達瑪烯二醇氧化為原人參二醇以及把原人參二醇進一步氧化為原人參三醇的細胞色素P450元件CYP716A4和CYP716A53v2。
[0007]利用合成生物學方法來人工合成這些具有藥用活性的人參皂苷，不僅需要構建合成皂苷元的代謝途徑，還需要鑒定催化人參皂苷的糖基化的UDP-糖基轉移酶。UDP-糖基轉移酶的功能是將糖基供體(核苷二磷酸糖，例如UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖)上的糖基轉移到不同的糖基受體上。從目前已測序的植物基因組分析，植物基因組往往編碼了上百種以上不同的糖基轉移酶。2015年中國學者鑒定了能在原人參三醇C6位轉入一個葡萄糖基的UDP-糖基轉移酶元件(UGTPg100)。中國學者在專利(PCT/CN2015/081111)公開了可以在原人參三醇型皂苷的C6位進行糖鏈延伸的糖基轉移酶(gGT29-7等)，如gGT29-7可以利用UDP-Xyl催化Rh1的C6位延伸一分子木糖基生成三七皂苷R2，可以利用UDP-Glc催化Rh1的C6位延伸一分子葡萄糖糖基生成人參皂苷Rf，但基本無法利用UDP-Rha催化Rh1的C6位延伸一分子鼠李糖基生成人參皂苷Rg2；雖然后續專利(PCT/CN2015/081111)公開的gGT29-7的突變體gGT29-7(N343G，A359P)能夠利用UDP-Rha催化Rh1的C6位延伸一分子鼠李糖基生成Rg2，但活性非常低，僅大約9％轉化率，不能完全滿足應用的需求。
[0008]因此，本領域還需要開發進一步優化的糖基轉移酶。

技術實現思路

[0009]本專利技術提供了高效的糖基轉移酶及其應用，用于催化四環三萜類化合物糖基化反應。
[0010]在本專利技術的第一方面，提供糖基轉移酶的突變體，所述突變體包括：(a)氨基酸序列對應于SEQ ID NO:12(野生型gGT29-7)，發生第362位、第15位和/或第54位的突變；或，氨基酸序列對應于SEQ ID NO:12，發生第362位、第15位和/或第54位的突變，且發生第343位和第359位的突變；(b)將(a)蛋白的氨基酸序列經過一個或多個(如1-20個；較佳地1-15個；更佳地1-10個，如5個，3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；(c)與(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上(較佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；(d)(a)～(c)任一所述蛋白的活性片段，其包含糖基轉移酶gGT29-7空間結構中與糖基供體、糖基受體相互作用的結構，且在對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；或，(e)(a)～(d)任一所述蛋白的兩端添加標簽序列、信號序列或分泌信號序列后形成的蛋白。
[0011]在一個或多個實施方案中，所述的糖基轉移酶突變體中，第362位突變為Tyr(Y)、第15位突變為Trp(W)和/或第54位突變為Met(M)；或，所述的第343位突變為Gly(G)，第359位突變為Pro(P)。
[0012]在一個或多個實施方案中，(a)中，所述突變體具有SEQ ID NO:10、4、6、8或所示的氨基酸序列。
[0013]在本專利技術的另一方面，提供分離的多核苷酸，所述的核酸是編碼所述的糖基轉移
酶突變體。
[0014]在一個或多個實施方案中，所述的多核苷酸選自以下的一種或多種：(A)編碼如SEQ ID NO:10、4、6、8所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；(B)如SEQ ID NO:9、3、5、7所示的本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.糖基轉移酶的突變體，所述突變體包括：(a)氨基酸序列對應于SEQ ID NO:12，發生第362位、第15位和/或第54位的突變；或，氨基酸序列對應于SEQ ID NO:12，發生第362位、第15位和/或第54位的突變，且發生第343位和第359位的突變；(b)將(a)蛋白的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；(c)與(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；(d)(a)～(c)任一所述蛋白的活性片段，其包含糖基轉移酶gGT29-7空間結構中與糖基供體、糖基受體相互作用的結構，且在對應于SEQ ID NO:12的第362、15、54、343和/或359位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；或(e)(a)～(d)任一所述蛋白的兩端添加標簽序列、信號序列或分泌信號序列后形成的蛋白。2.如權利要求1所述的糖基轉移酶的突變體，其特征在于，所述的糖基轉移酶突變體中，第362位突變為Tyr、第15位突變為Trp和/或第54位突變為Met；或，所述的第343位突變為Gly，第359位突變為Pro。3.如權利要求1所述的糖基轉移酶的突變體，其特征在于，(a)中，所述突變體具有SEQ ID NO:10、4、6、8或所示的氨基酸序列。4.分離的多核苷酸，所述的核酸是編碼權利要求1所述的糖基轉移酶突變體。5.一種核酸構建物或載體，它含有權利要求4所述的多核苷酸，或表達權利要求1所述的糖基轉移酶的突變體。6.一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有權利要求5所述的核酸構建物或載體，或基因組中整合有權利要求4所述的多核苷酸，或表達權利要求1所述的糖基轉移酶的突變體。7.如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述細胞中包括原核細胞或真核細胞；較佳地，所述的原核細胞包括大腸桿菌細胞、枯草桿菌細胞；較佳地，所述真核細胞包括酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞；較佳地，所述植物細胞包括人參細胞或三七細胞。8.如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，其還表達達瑪烯二醇和/或原人參二醇型皂苷和/或原人參三醇型皂苷合成代謝途徑中關鍵酶；或，所述宿主細胞還包括達瑪烯二醇和/或原人參二醇型皂苷和/或原人參三醇型皂苷合成代謝途徑中的關鍵酶的編碼基因或含有所述編碼基因的核酸構建物。9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述的原人參三醇型皂苷包含人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re4、三七皂苷R3、三七皂苷Fp1、西洋參皂苷L17、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、Floralgensenoside M、Yesanchinoside E、Floralgensenoside N、Floralquinquenoside E。10.如權利要求9所述的宿主細胞，其特征在于，所述的人參皂苷Rh1合成代謝途徑中的關鍵基因包括：達瑪烯二醇合成酶基因、細胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47
的還原酶基因和四環三萜C6的糖基轉移酶UGTPg100，或其組合；或所述的人參皂苷Rg1合成代謝途徑中的關鍵基因包括：達瑪烯二醇合成酶基因、細胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的還原酶基因和四環三萜C20位和C6的糖基轉移酶UGTPg1和UGTPg100，或其組合；或所述的人參皂苷Rg2合成代謝途徑中的關鍵基因包括：達瑪烯二醇合成酶基因、細胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的還原酶基因和四環三萜C6的糖基轉移酶UGTPg100以及本文中催化C6位糖基延伸的糖基轉移酶，或其組合；或所述的人參皂苷Re合成代謝途徑中的關鍵基因包括：達瑪烯二醇合成酶基因、細胞色素P450 CYP716A47基因和P450 CYP716A47的還原酶基因和四環三萜C20位和C6的糖基轉移酶UGTPg1和UGTPg100以及本文中催化C6位糖基延伸的糖基轉移酶，或其組合。11.權利要求1～3任一所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周志華，李超靜，嚴興，王平平，楊成帥，
申請(專利權)人：周志華，
類型：發明
國別省市：