白蛋白親和劑及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種白蛋白親和劑，其選自肽SP、其丙氨酸掃描肽、其逆序翻轉肽

【技術實現步驟摘要】
白蛋白親和劑及其應用


[0001]本專利技術涉及生物領域，尤其涉及一種白蛋白親和劑。

技術介紹
:
[0002]血清白蛋白是由肝臟合成并分泌的，是血漿中最豐富的蛋白質之一，其功能主要是通過血液轉運激素、脂肪酸和多種化合物，此外，白蛋白還有助于維持血液滲透壓。人血清白蛋白具有與多種配體相互作用的能力，包括多種外源性藥物，當前人血清白蛋白被用于載藥工具來改善藥物的半衰期。藥物與人血清白蛋白的相互作用通常會增加藥物的分布和生物利用度，具體取決于藥物分子的特定藥代動力學特性。此外，由于其含量豐富，人血清白蛋白在多種藥物的藥代動力學行為中起著重要作用，包括：血液中的藥物半衰期，調節藥物功效，降低藥物毒性以及改善藥物靶向特異性。有文獻報道，通過噬菌體展示肽庫技術篩選出白蛋白親和短肽，融合目標靶向肽，在體內形成一個復雜的白蛋白
?
多肽結構，以白蛋白作為載體運送藥物在血液中循環，避免被腎小球過濾，在不影響其原有抗血管生成的作用下，顯著增加了藥物半衰期。經白蛋白親和肽修飾后的藥物可以與HSA特異性結合，從而延長其循環壽命，在體內逐漸被蛋白酶水解后，緩慢釋放偶聯的生物活性藥物，相較于其他修飾方法能夠使藥物在體內持續發揮作用，且不影響藥物原有的生物活性。目前針對延長多肽類小分子藥物半衰期并延長藥物在體內代謝時間的研究已有很多，能夠有效延長藥物在體內存留的時間，在體內長期發揮藥效，有利于在臨床上降低給藥劑量，減少用藥頻率。

技術實現思路

[0003]一方面，本專利技術提供了白蛋白的親和劑，其選自下述化合物組：
[0004]組a：SEQ ID NO.1所示肽SP、其丙氨酸掃描肽、其逆序翻轉肽
D
SP或式I所示的
D
SP碳端衍生物肽SP各氨基酸均為L型，其丙氨酸掃描肽的氨基酸序列獨立選自SEQ ID NOs：5
?
8，肽
D
SP氨基酸序列為SEQ ID NO.13且各氨基酸均為D型，式I中各模塊的含義：
D
SP表示序列同肽
D
SP的肽基且組成該肽基的氨基酸均為D型，P1、P2為靶向肽，L1、L2、L3為連接子且共同用于避免
D
SP、P1、P2發揮功能時彼此干擾；
[0005]組b：多肽b，其氨基酸序列獨立選自SEQ ID NOs：2
?
4或SEQ ID NOs：9
?
12，所述肽b 的各個氨基酸的構型獨立地選自D型或L型，如，各氨基酸均為D型或L型。
[0006]所述親和劑在本領域指能親和白蛋白的分子，本專利的親和劑，可以游離形式存在，也可以其藥學上可接受的鹽的形式存在，基于本專利思路的簡單變形，均構成對本專利的等同侵權。為行文簡潔，對不分構型的甘氨酸，本專利亦將其任意歸入D型或L型；對D型氨基酸，用L型氨基酸縮寫字母的小寫形式表示，其他情況下，如無特別說明，氨基酸的構型為
PBS7.4(含有0.1％Tween
?
20)溶解成摩爾濃度為400μM備用，取10μL的多肽用PBST 倍比稀釋成16個濃度梯度樣品，再加入10μL標記后的蛋白，混勻后離心除去氣泡(此時多肽濃度為100μM)，小心取毛細管吸引混合后的樣品按順序放入托盤上進行檢測。在專用軟件上點擊start scan圖標，測定每管樣品熒光的一致性，然后點擊start measurement圖標開始檢測。
[0024]e)分析數據：選用專用Mo.Control(
×
86)軟件進行分析。
[0025]MST實驗結果表明NP、SP、TR、MF肽可與HSA特異性親和，多數對MSA亦有較好的親和能力。親和力數據見后附表。
[0026]3.SP肽及MF肽的丙氨酸掃描肽的合成
[0027]a)丙氨酸掃描是將多肽鏈某一氨基酸置換成丙氨酸，相當于除去了側鏈上的活性基團，換成了無其他官能團的甲基。觀察置換丙氨酸后對多肽功能的影響，由此可以推斷出多肽鏈中發揮作用的關鍵氨基酸，為后續的多肽優化提供思路。為了確定親和力較高的兩條肽SP和MF與HSA相互作用的關鍵位點，為后續優化提供基礎，我們將SP和MF肽序列中每一個氨基酸依次替換成丙氨酸，共得到七條SP肽丙氨酸掃描肽序列和七條 MF肽丙氨酸掃描肽序列。
[0028]b)SP肽丙氨酸掃描結果發現將第一位、第三位和第七位氨基酸置換成丙氨酸后多肽與 HSA無親和能力，而將多肽鏈中第五位和第六位氨基酸置換成丙氨酸后嚴重影響了多肽與HSA的親和能力，但將多肽鏈中第二位和第四位氨基酸替換成丙氨酸后對多肽的功能無影響。故可推斷，SP肽序列中第一位、第三位、第五位、第六位和第七位為SP 與HSA相互作用的關鍵位點。
[0029]c)MF肽丙氨酸掃描結果發現將第四位、第六位和第七位氨基酸置換成丙氨酸后多肽與 HSA無親和能力，而將多肽鏈中第二位和第五位氨基酸置換成丙氨酸后嚴重影響了多肽與HSA的親和能力，但將多肽鏈中第一位和第三位氨基酸替換成丙氨酸后對多肽的功能無影響。故可推斷，MF肽序列中第二位、第四位、第五位、第六位和第七位為 MF與HSA相互作用的關鍵位點。
[0030]丙氨酸掃描肽親和結果見后附表。
[0031]4.SP肽經逆序翻轉得到
D
SP肽
[0032]對SP肽進行結構預測，發現其結構并非為α螺旋結構，將組成SP肽的L
?
氨基酸替換為D
??
氨基酸，再將其逆序排列后仍能保持SP肽的原有結構；將SP肽經逆序翻轉得到的全由D 構型氨基酸組成的肽命名為的
D
SP肽。經MST實驗證明
D
SP肽與HSA和MSA仍具有很強的親和力。
[0033]5.
D
SP肽偶聯治療肽使治療肽半衰期顯著延長
[0034]將治療肽OGS肽和
D
SP肽偶聯得到的
D
SPOGS肽偶聯物以8μmol/kg的劑量通過尾靜脈注射到SD大鼠體內。注射后在不同時間點尾靜脈取血，經蛋白沉淀等處理后,用RP
?
HPLC分析樣品檢測血液中多肽的含量。結果表明OGS肽的半衰期為29.94
±
2.00min,
D
SPOGS的半衰期為326.08
±
72.31min，經
D
SP修飾后OGS肽的半衰期顯著延長。
[0035]6.在MC38結直腸癌移植瘤模型中探究OGS肽和肽偶聯物
D
SPOGS的抗腫瘤效果，具體實施方法如下：
[0036]a)荷瘤：收集生長狀態良好的MC38結直腸癌細胞，以1
×
106cells/只對C57BL/6小
鼠荷瘤。
[0037]b)待荷瘤一周左右，小鼠瘤體積小鼠瘤體積約長至40
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80mm3時開始S形分組并每天腹腔給藥，給藥劑量為3μmol/kg，連續給藥18天，給藥期間隔天使用本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.白蛋白的親和劑，其選自下述化合物組：組a：SEQ ID NO.1所示肽SP、其丙氨酸掃描肽、其逆序翻轉肽
D
SP或式I所示的
D
SP碳端衍生物肽SP各氨基酸均為L型，其丙氨酸掃描肽的氨基酸序列獨立選自SEQ ID NOs：5
?
8，肽
D
SP氨基酸序列為SEQ ID NO.13且各氨基酸均為D型，式I中：
D
SP表示序列同肽
D
SP的肽基且組成該肽基的氨基酸均為D型，P1、P2為靶向肽，L1、L2、L3為連接子且共同用于避免
D
SP、P1、P2發揮靶向功能時彼此干擾；組b：多肽b，其氨基酸序列獨立選自SEQ ID NOs：2
?
4或SEQ ID NOs：9
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12，所述肽b的各個氨基酸的構型獨立地選自D型或L型，如，各氨基酸均為D型或L型。2.如權利要求1所述的親和劑，其特征是，所述P1、P2獨立選自靶向VEGFR2的肽或靶向PD
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L1的肽，所述靶向VEGFR2的肽的序列可為rpp...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高艷鋒，焦玲，翟文杰，高銘，
申請(專利權)人：鄭州大學，
類型：發明
國別省市：