一種核桃肽及其制備方法和應用技術

本發(fā)明專利技術公開了一種核桃肽及其制備方法和應用，屬于生物活性肽技術領域。本發(fā)明專利技術所述核桃肽為分子量1189.186Da的單鏈多肽，核桃肽結構序列為GEEREERGLD。本發(fā)明專利技術通過對核桃粕漿復合酶解得到核桃蛋白，在核桃蛋白溶液中依次添加堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行酶解得到核桃蛋白漿酶解產物，再采用高效液相法分離純化得到本發(fā)明專利技術所述核桃肽。本發(fā)明專利技術提供的核桃肽具有較高的抗氧化活性，對H2O2誘導的PC12細胞具有明顯的保護作用，同時對中樞神經(jīng)具有保護功效；本發(fā)明專利技術提供的核桃肽可以有效改善實驗動物空間記憶力和學習探索能力。間記憶力和學習探索能力。間記憶力和學習探索能力。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種核桃肽及其制備方法和應用


[0001]本專利技術涉及生物活性肽
，具體涉及一種核桃肽及其制備方法和應用。

技術介紹

[0002]核桃，又稱胡桃，羌桃，為胡桃科植物。與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”。核桃仁含有豐富的營養(yǎng)素，每百克含脂肪較多，蛋白質15~20克，碳水化合物10克；并含有人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素和礦物質，以及胡蘿卜素、核黃素等多種維生素，深受人們喜愛。
[0003]核桃粕是核桃榨油時的副產物，目前僅被用作飼料或肥料，這使得核桃粕中的營養(yǎng)物質沒有得到充分利用，特別是其中的生物活性物質被忽視。高營養(yǎng)價值的核桃粕的利用率不高導致產品增值較低。近幾十年，生物活性肽的發(fā)展為核桃粕的精深加工帶來了新思路。核桃粕蛋白酶解物具有較多的生物活性，多肽多樣的生物活性功能和良好的加工特性使其逐漸成為研究的熱點。
[0004]記憶力下降作為一種臨床癥狀在很多神經(jīng)退行性疾病中都有表現(xiàn)，目前研究較多的有阿爾茲海默病、血管性癡呆、帕金森癥、鋁中毒、癲癇等。記憶力下降作為神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過程中顯著的特征而廣受關注。神經(jīng)退行性疾病的成因有很多，包括β
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淀粉樣肽（Aβ）的積淀、膽堿功能系統(tǒng)功能紊亂、谷氨酸含量過高、線粒體作用紊亂、氧化應激及炎癥釋放等。由此可見，對神經(jīng)退行性疾病中記憶能力的調控趨勢是多方位多靶點的。因此，開發(fā)具有預防、改善記憶力下降及認知功能退化的活性物質成為科學工作者的重點。
[0005]核桃蛋白是一種包含18種氨基酸且8種必需氨基酸種類齊全、含量合理的優(yōu)質植物蛋白。其中谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）和天冬氨酸（Asp）對于維持人體神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的作用。核桃肽中起神經(jīng)保護、輔助改善記憶作用的多肽序列結構尚未有大量的研究。現(xiàn)有的核桃肽提取工藝存在成本高、浪費大，不利于工業(yè)化的問題，并且酶解過程常采用各種蛋白酶一起參與整個酶解過程，忽略了蛋白酶之間的差異性，從而存在酶解效果不理想，制備得到的核桃肽質量不高的問題。

技術實現(xiàn)思路

[0006]為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種核桃肽，所得核桃肽對中樞神經(jīng)具有保護功效，可以有效改善實驗動物空間記憶力和學習探索能力。
[0007]本專利技術的目的還在于提供了上述核桃肽的制備方法和應用。
[0008]為了實現(xiàn)上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：本專利技術提供了一種核桃肽，所述核桃肽為單鏈多肽，結構序列為GEEREERGLD。
[0009]優(yōu)選的，所述肽鏈分子量為1189.186Da。
[0010]本專利技術還提供了上述核桃肽的制備方法，包括以下步驟：（1）核桃粕漿用纖維素酶和果膠酶進行酶解，滅酶后過濾干燥，得到核桃蛋白；（2）制備核桃蛋白漿，將核桃蛋白漿在50~60℃保溫，調節(jié)pH后依次用堿性蛋白酶、
木瓜蛋白酶進行酶解，得到核桃蛋白酶解液；（3）所述核桃蛋白酶解液中加入活性炭保溫、過濾、干燥，得核桃肽混合物；（4）將核桃肽混合物制備成溶液，采用高效液相色譜分離純化得到核桃肽GEEREERGLD。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟（1）中纖維素酶的添加量為1200~1800U/mL，果膠酶的添加量為400~600U/mL，核桃粕漿液在pH值6~7、溫度為50~55℃下酶解3~5 h。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟（2）中堿性蛋白酶酶解4.5~5.5 h后，加入木瓜蛋白酶繼續(xù)酶解3.5~4.5 h；堿性蛋白酶的添加量為450~550U/mL，木瓜蛋白酶的添加量為200~300U/mL，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解pH值為8~8.5、溫度為50~60℃。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟（4）中核桃肽混合物配制得到濃度為0.8~1.2 mg/mL的水溶液。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟（4）中采用高效液相色譜進行兩次分離純化，以流動相A：水+0.1%三氟乙酸，流動相B：乙腈+0.1%三氟乙酸進行梯度洗脫得到核桃肽GEEREERGLD。
[0015]優(yōu)選的，第一次高效液相色譜條件如下：采用規(guī)格為550mm
×
40μm，20μm的制備型液相色譜柱流速14~15mL/min；洗脫程序為0~5min 5%B，5~15min 5%B~25%B，15~45min 25%~55%B；收集21~24min的洗脫流份。
[0016]優(yōu)選的，第二次高效液相色譜條件如下：采用規(guī)格為250mm
×
4.6mm，5μm的Agilent Plus C18色譜柱；流速0.4~0.5mL/min；洗脫程序為0~10min 5%B，10~25min 80%B，25~30min 5%B；收集20~24min的洗脫流份。
[0017]本專利技術還提供了上述核桃肽在制備神經(jīng)保護和/或記憶力改善產品中的應用。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本專利技術的技術方案的有益效果如下：本專利技術制備得到的核桃肽具有較高的抗氧化活性，對H2O2誘導的PC12細胞具有明顯的保護作用，可以抑制細胞凋亡；同時，本專利技術制備得到的核桃肽對中樞神經(jīng)具有保護功效，可以改善學習和記憶能力。
[0019]本專利技術核桃肽的制備方法簡單，成本低、浪費少，可用于工業(yè)化生產。
附圖說明
[0020]圖1為核桃肽序列結構；圖2為樣品處理后斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細胞典型圖；圖3為核桃肽T2對實驗動物體重（g）的影響；圖4為核桃肽T2對實驗動物臟器系數(shù)（%）的影響；圖5為核桃肽T2對礦場實驗中的中心區(qū)域訪問次數(shù)的影響；圖6為核桃肽T2對礦場實驗中總運動距離的影響；圖7為核桃肽T2對礦場實驗中時間的影響；圖8為礦場實驗動物活動路線示意圖；圖9為核桃肽T2對新物體識別實驗中次數(shù)認知指數(shù)的影響；圖10為核桃肽T2對新物體識別實驗中運動距離認知指數(shù)的影響；圖11為核桃肽T2對新物體識別實驗中時間認知指數(shù)的影響；圖12為新物體識別實驗動物活動路線示意圖；圖13為核桃肽T2對T迷宮實驗中新異臂的移動距離占總移動距離比例的影響；
圖14為核桃肽T2對T迷宮實驗中停留時間的影響；圖15為T迷宮實驗動物活動路線示意圖；圖16為核桃肽T2對實驗動物Morris水迷宮中游泳速度的影響；圖17為核桃肽T2對實驗動物Morris水迷宮中穿越平臺次數(shù)的影響；圖18為核桃肽T2對實驗動物Morris水迷宮中逃避潛伏期的影響；圖19為核桃肽T2對實驗動物Morris水迷宮中游泳距離的影響；圖20為核桃肽T2各實驗動物Morris水迷宮第三天典型運動軌跡；圖21為核桃肽T2各實驗動物Morris水迷宮第四天典型運動軌跡；圖22為核桃肽T2對實驗動物大腦海馬組織的影響；圖23為核桃肽T2對實驗動物血清生化指標的影響；圖24為核桃肽T2對實驗動物腦組織生化指標的影響。
具體實施方式
[0021]本專利技術提供了一種核桃肽，鑒定其結構為GEEREERGLD的單鏈多肽，分子量為1189.186Da，序列結構見圖1。
[0022]本專利技術所述核桃肽是從脫脂核桃粕中酶解、分離、純化得本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種核桃肽，其特征在于，所述核桃肽為單鏈多肽，結構序列為GEEREERGLD。2.根據(jù)權利要求1所述的核桃肽，其特征在于，肽鏈分子量為1189.186Da。3.權利要求1~2任意一項所述核桃肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）核桃粕漿用纖維素酶和果膠酶進行酶解，滅酶后過濾干燥，得到核桃蛋白；（2）制備核桃蛋白漿，將核桃蛋白漿在50~60℃保溫，調節(jié)pH后依次用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行酶解，得到核桃蛋白酶解液；（3）所述核桃蛋白酶解液中加入活性炭保溫、過濾、干燥，得核桃肽混合物；（4）將核桃肽混合物制備成溶液，采用高效液相色譜分離純化得到核桃肽GEEREERGLD。4.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）中纖維素酶的添加量為1200~1800U/mL，果膠酶的添加量為400~600U/mL，核桃粕漿液在pH值6~7、溫度為50~55℃下酶解3~5 h。5.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）中堿性蛋白酶酶解4.5~5.5 h后，加入木瓜蛋白酶繼續(xù)酶解3.5~4.5 h；堿性蛋白酶的添加量為450~550U/mL，木瓜蛋白酶的添加量為200~300U/mL，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解pH值為8~8.5、溫度為50~60℃...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張釗，張九勛，李庚，張學軍，張西平，魏瑋，趙冉，周喜高，左喜梅，
申請(專利權)人：中食都慶山東生物技術有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：