一種高純度CD56+γδT細胞及其制備方法和用途技術

本發明專利技術提供一種高純度CD56+γδT細胞，一種高效誘導和大量擴增CD56+γδT細胞的培養方法，和將CD56+γδT細胞用于治療肺癌、胃癌、胰腺癌和膀胱癌等癌癥的用途。所培養的CD56+γδT細胞增殖能力強，殺瘤能力強，可以較好地解決γδT細胞來源問題，并有應用于臨床的前景。景。景。

【技術實現步驟摘要】
一種高純度CD56+
γδ
T細胞及其制備方法和用途


[0001]本專利技術涉及免疫治療領域，具體涉及一種高純度CD56+γδT細胞、高效誘導和擴增所述高純度CD56+γδT的培養基和培養方法、以及所述高純度CD56+γδT細胞治療腫瘤的用途。

技術介紹

[0002]免疫系統對癌癥的先天和獲得性免疫可以在稱為癌癥免疫監視的過程中識別和破壞新生的腫瘤細胞。正常細胞受致癌物和其他遺傳毒性損害以及內在的腫瘤抑制機制(例如p53，ATM，Ras)失效而轉化為腫瘤細胞。這些腫瘤細胞表達應激誘導的分子，例如表面鈣網蛋白，MHC I類分子的腫瘤抗原，NKG2D配體等，它們可分別被免疫細胞識別。T淋巴細胞是免疫系統的重要組成部分，根據T細胞表面受體(TCR)不同，T淋巴細胞可以分為αβT和γδT。αβT主要參與獲得性免疫，γδT主要參與先天性免疫。目前主要的CART產品以αβT為主，將抗原抗體的高親和性和T淋巴細胞的殺傷作用相結合，通過構建特異性嵌合抗原受體，經基因轉導使T淋巴細胞表達這種嵌合抗原受體，特異性地識別靶抗原從而殺傷靶細胞。與αβT細胞相比，γδT具有以下優勢，有望成為通用CART的候選藥物。
[0003]1.大多數癌細胞除了具有抗原和信號外，還能分泌一種叫做IPP(異戊烯焦磷酸)的物質。目前，在免疫細胞中，只發現γδT細胞具有這種識別IPP的功能，在激活和增殖細胞后可攻擊癌細胞。
[0004]2.γδT細胞腫瘤浸潤性強，研究發現TIL中γδT數量豐富，已在多種類型的癌癥(包括結直腸癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和腎細胞癌)中分離得到γδT細胞性質的TIL。在常規藥物難以進入的腫瘤，例如胰腺癌中，γδT，浸潤性是影響療效的主要因素之一。
[0005]3.γδT作為先天免疫細胞，反應比αβT細胞更快，在沒有CAR的情況下，對腫瘤細胞也能具有殺傷能力，因此不受常規的突變影響，還可以繞過最常見的癌癥免疫逃逸機制之一——表面MHC I類分子的下調。
[0006]4.αβT識別抗原需要依賴HLA分子的提呈，不同個體HLA系統具有特異性，除非供者和受體的HLA分子精確匹配，否則供者αβT將與受體發生免疫排斥反應。而γδT細胞識別抗原不依賴HLA分子的提呈，不會將患者的身體識別為外來物，因此不會引起GvHD(移植物抗宿主病)。
[0007]5.γδT細胞對普通細胞更安全，尚沒有與γδT細胞療法相關的嚴重的不良反應的報道，而αβT會有“脫靶”現象，產生不良反應。
[0008]CD56是一種神經細胞粘附分子，通常被認為是自然殺傷細胞(NK)的表型標志物，NK細胞通常定義為CD3
?
CD56+，而CD3+/CD56+細胞通常被命名為NKT或NKT樣細胞，常見的NKT多為αβT。到目前為止，CD56細胞的表達對淋巴細胞的功能尚不夠清楚，可能與淋巴細胞與靶細胞之間的粘附有關。CD56+γδT細胞表現出來的優點包括：
[0009]1、殺傷腫瘤細胞能力更強。
[0010]2、主要以穿孔素顆粒酶途徑殺傷靶細胞，速度快。
[0011]3、CD56+γδT細胞的CD16表達水平高于CD56
?
γδT細胞，因此CD56+γδT細胞的抗體依賴的細胞細胞毒性作用(ADCC，antibody
?
dependent cell
?
mediated cytotoxicity)效應更強。
[0012]4、CD56+γδT對CD95抗體的敏感性低于CD56
?
γδT細胞，因此CD56+γδT細胞的抗凋亡能力更強。
[0013]目前，已有包括Omn在內的十幾種γδT相關細胞療法進入臨床實驗，現有技術中也有多種用于擴增γδT細胞的方案，例如使用唑來膦酸或其他磷酸抗原，干擾素
?
γ(IFN
?
γ)，白介素2(IL
?
2)，白介素15(IL15),CD3抗體或飼養細胞來誘導PBMC、擴增γδT細胞。(參見ZL201910404788.5；ZL201910408512.4；ZL201910791742.3；ZL202110815574.4；ZL201980062358.8以及Am J Cancer Res,2021.11(1):p.79
?
91；Front Immunol,2020.11:p.1347；Sci Immunol,2018.3(30),eaav4036)，但目前的培養體系還存在如下問題：
[0014]尚未有高效的CD56+γδT細胞的誘導方法，也未有專門的培養擴增體系，已有的培養體系中利用唑來膦酸、IL15雖然也能誘導一定比例的CD56表達，但擴增能力相對較差，且γδT純度只有60～70％左右。純度低、產量低、成本高，且摻雜的αβT不僅不能殺滅癌細胞，還產生副作用，因而成為推廣應用的重要阻礙。

技術實現思路

[0015]因此，本專利技術要解決的技術問題在于克服現有技術中γδT細胞擴增困難、殺瘤效果不理想的缺陷，從而提供一種高純度CD56+γδT細胞，γδT細胞占細胞總數的90％以上，CD56高表達的CD56+γδT細胞占γδT細胞總數的75％以上。
[0016]本專利技術還進一步給出了所述高純度CD56+γδT細胞治療腫瘤的用途。
[0017]本專利技術要解決的另一個技術問題在于克服現有技術中的誘導γδT細胞效率較低的缺陷，從而提供一種高效誘導和擴增所述高純度CD56+γδT的培養基，并提供了相應的培養方法。
[0018]誘導和擴增的具體方案如下：
[0019]1.分離單個核細胞(PBMC)：從外周血中用淋巴細胞分離液分離PBMC；
[0020]2.分選γδT細胞：按照10ul/1*107的用量加入分選抗體和磁珠，將γδT細胞從PBMC中分選出來，流式檢測CD3+γδT所占比例。所得γδT細胞純度＞90％。
[0021]3.γδT細胞的激活：用含5％FBS的T009培養基按照濃度2*106個/ml重懸分選的γδT細胞，培養基中加入10～100ng/ml CD3抗體激活，37℃，5％CO2，培養過夜。
[0022]4.CD56+γδT細胞的誘導：使用特制培養基，37℃，5％CO2，進行培養。
[0023]5.每隔1～3天，向培養基中補液，控制細胞濃度，培養2～3周后收獲CD56+γδT細胞。
[0024]6.流式檢測CD3+γδT所占比例、Vδ1T、Vδ2T亞型、CD56、CD16、CD4、CD8、CD45RA、CCR7、CD28。
[0025]本專利技術提供一種特制培養基，在含5％FBS的T009培養基基礎上，向培養基中加入10～200ng/ml IL15,10～1000ng/ml pVC(L
?
抗壞血酸
?2?
磷酸鹽)，獲得基礎型培養基。
[0026]作為一種優選的方案，還向基礎型培養基中加入10～200ng/ml本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種高純度CD56+γδT細胞，其特征在于，γδT細胞占細胞總數的90％以上，CD56高表達的CD56+γδT細胞占γδT細胞總數的75％以上。2.根據權利要求1所述的高純度CD56+γδT細胞在制備腫瘤治療劑中的用途。3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為肺癌、胃癌、胰腺癌或膀胱癌。4.一種用于治療腫瘤的制劑，其特征在于，包括權利要求1或2所述的高純度CD56+γδT細胞。5.根據權利要求4所述的制劑，其特征在于，所述腫瘤為肺癌、胃癌、胰腺癌或膀胱癌。6.一種培養基，其特征在于，在含5％FBS的T009培養基的基礎上，還包括如下成分：10～200ng/ml IL15和10～1000ng/ml pVC(L
?
抗壞血酸
?2?
磷酸鹽)。7.根據權利要求6所述的培養基，其特征在于，還包括下列三種額外成分中的任一種；(1)1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：方小燕，徐南，康立清，俞磊，譚靖雯，葉晶，賈裕杰，
申請(專利權)人：上海優卡迪生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：