本發明專利技術涉及微生物技術領域，具體涉及一種綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70、重組表達載體、工程菌及其應用。所述綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70，其特征在于，所述基因的CDS的核苷酸序列為如下(a1)～(a3)任意一種：(a1)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；(a2)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列經一個或多個核苷酸的替換、缺失或插入形成的序列；(a3)在嚴格條件下能夠與如(a1)或(a2)所述的核苷酸序列雜交并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。本發明專利技術構建篩選具有較強抗逆性的木霉工程菌株，有效提高了促進木霉的生長性能，提高了抗逆性、對病原菌的拮抗能力，以及木霉對植物的促生能力。植物的促生能力。植物的促生能力。
【技術實現步驟摘要】
綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70、重組表達載體、工程菌及其應用
[0001]本專利技術涉及微生物
，具體涉及一種綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70、重組表達載體、工程菌及其應用。
技術介紹
[0002]公開該
技術介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
[0003]木霉(Trichoderma spp.)屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、木霉屬，是一種重要的多功能的絲狀真菌，是工業上重要的酶制劑生產菌株，是土壤環境中有毒物質的降解菌株，是農業生產中重要的植病生防菌株，也是復合微生物有機肥和全元生物有機肥中重要的微生物菌種之一，在工農業生產及環境保護領域都有著廣泛的應用。
[0004]在生產、保存、運輸以及工農業應用中，木霉不可避免的要面對一些不利環境，這直接影響木霉生存，進而影響其工農業生產能力。以木霉菌生物有機肥為例，木霉作為功能菌株，需要先適應所處的環境并在其周圍大量定殖才能發揮促生、增產、防病等多重作用。但是在實驗篩選獲得的優良木霉菌株卻出現田間應用效果不穩定的情況。尤其是一些溫度過高的土壤環境條件下，木霉存活率低、定殖能力差，進而影響施肥效果，這也成為木霉菌生物有機肥料的大規模商品化生產的重要制約因子之一。因此，提高木霉對不利環境的適應能力具有重要意義。
技術實現思路
[0005]針對現有技術中存在的問題，本專利技術的目的是提供一種綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70、重組表達載體、工程菌及其應用，木霉產生的次級代謝產物種類豐富，生物活性多樣，很多代謝產物參與調控木霉對不利環境的適應能力，本專利技術利用基因工程技術對木霉進行遺傳改良，構建篩選具有較強抗逆性的木霉工程菌株，有效提高了促進木霉的生長性能，提高了抗逆性、對病原菌的拮抗能力，以及木霉對植物的促生能力，對促進木霉菌在工農業生產中廣泛應用具有重要的意義。
[0006]為了實現上述目的，本專利技術的技術方案如下所述：
[0007]在本專利技術的第一方面，提供一種綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70，所述基因的CDS的核苷酸序列為如下(a1)～(a3)任意一種：
[0008](a1)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；
[0009](a2)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列經一個或多個核苷酸的替換、缺失或插入形成的序列；
[0010](a3)在嚴格條件下能夠與如(a1)或(a2)所述的核苷酸序列雜交并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。
[0011]在本專利技術的第二方面，提供一種綠色木霉熱休克蛋白TvHSP70，其氨基酸序列為如下(b1)或(b2)：
[0012](b1)SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0013](b2)將(b1)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白質。
[0014]在本專利技術的第三方面，提供一種重組表達載體，所述重組表達載體含有第一方面中所述的綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70；
[0015]優選地，所述重組表達載體由綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70有效地連接到表達載體上獲得；
[0016]優選地，所述表達載體為病毒載體、質粒、噬菌體、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌體或人工染色體中的任意一種或多種；進一步優選為真菌質粒；更進一步優選為pBARGPE1
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Hygro質粒。
[0017]進一步優選地，重組表達載體pBARGPE1
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Hygro
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TvHSP70大小為8014bp，包含木霉啟動子gpdA、終止子TrpC、抗性篩選基因HygR以及TvHSP70基因表達盒的完整序列。
[0018]在本專利技術的第四方面，提供一種工程菌，所述工程菌中含有第一方面所述的綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70或第四方面所述的重組表達載體；所述TvHSP70基因在工程菌中過表達；
[0019]所述工程菌包括但不限于細菌和真菌，優選的，所述工程菌為木霉屬，優選的為綠色木霉，進一步優選為綠色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511，已于2018年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為：CGMCC NO.16800。該菌株已在專利號為ZL201910626525.9的專利中公開。
[0020]在本專利技術中，除重組表達載體和工程菌之外的其他含有所述TvHSP70基因的生物材料也在本專利技術的保護范圍之內；
[0021]所述生物材料包括表達盒、轉座子、宿主細胞或轉基因細胞系。
[0022]本專利技術中，所述載體和宿主細胞可理解為本領域技術人員在轉基因過程中所使用的載體和宿主細胞。但隨著科技發展，所述載體和宿主細胞的選擇也許會發生變化，或在非轉基因目的的應用領域，也同樣涉及載體和宿主細胞的利用，但只要含有本專利技術所述基因或本專利技術所述的載體，均在本專利技術的保護范圍之內。
[0023]本專利技術的第五個方面，提供上述綠色木霉熱休克蛋白基因TvHSP70、重組表達載體和工程菌的獲得方法；
[0024]其中，所述綠色木霉熱休克蛋白基因TvHSP70的獲得方法可以是人工合成或者以上述綠色木霉Tv
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1511基因組DNA或者cDNA為模板，用引物擴增得到，優選的，擴增引物為SEQ ID NO.21
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SEQ ID NO.24。
[0025]所述重組表達載體的獲得方法為上述基因或其基因表達盒有效地連入質粒，優選的，基因表達盒的構建中擴增引物為SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24，酶切連接位點為BamHI和EcoRI；優選的，質粒的構建中采用pBARGPE
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Hygro線性載體，將TvHSP70基因表達盒連入經BamHI和EcoRI雙酶切的pBARGPE1
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Hygro線性載體中即得。
[0026]所述工程菌的構建方法為將上述重組表達載體轉入宿主細胞原生質體中；優選
的，所述宿主細胞原生質體為木霉原生質體，或者轉入方法包括生物學上可接受的直接轉化法(包括基因槍法、電擊法、超聲波法、顯微注射法、PEG法)或者間接轉化法(包括DNA病毒載體介導法、農桿菌介導法)，優選的，利用PEG
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CaCl2法；優選的，所述木霉為綠色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511。
[0027]本專利技術的第六個方面，提供上述綠色木霉熱休克蛋白基因TvHSP70、綠色木霉熱休克蛋白TvHSP70、重組表達載體和/或工程菌在如下任意一種或多種中的應用：
[0028](c1)促進木霉的生長；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70，其特征在于，所述基因的CDS的核苷酸序列為如下(a1)～(a3)任意一種：(a1)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；(a2)如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列經一個或多個核苷酸的替換、缺失或插入形成的序列；(a3)在嚴格條件下能夠與如(a1)或(a2)所述的核苷酸序列雜交并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。2.一種綠色木霉熱休克蛋白TvHSP70，其特征在于，其氨基酸序列為如下(b1)或(b2)：(b1)SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b2)將(b1)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白質。3.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體含有權利要求1所述的綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70。4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體由綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70有效地連接到表達載體上獲得；優選地，所述表達載體為病毒載體、質粒、噬菌體、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌體或人工染色體中的任意一種或多種；進一步優選為真菌質粒；更進一步優選為pBARGPE1
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Hygro質粒。5.一種工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有權利要求1所述的綠色木霉高溫脅迫響應關鍵酶基因TvHSP70或權利要求3所述的重組表達載體。6.如權利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括細菌和真菌，優選的，所述工程菌為木霉屬，進一步優選為綠色木霉，更進一步優選為綠色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511，已于2018年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為：CGM...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃艷華，霍雪雪，郭凱，任宗明，田志喜，李哲，鄭澤慧，郝永任，
申請(專利權)人：中國科學院遺傳與發育生物學研究所山東師范大學，
類型：發明
國別省市：
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