【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】餐時或基礎胰島素類似物通過內部二硒橋的穩定化
[0001]相關申請的交叉引用本申請要求2019年4月19日提交的第62/836,264號美國臨時專利申請的優先權，其內容通過全文引用并入本申請。
[0002]關于聯邦贊助的聲明研究或開發本專利技術是在美國國立衛生研究院授予的DK 040949和DK 118536的政府支持下完成的。政府具有本專利技術的某些權利。
[0003]通過引用并入電子提交的材料通過全文引用并入的是一段計算機可讀核苷酸/氨基酸序列表，其與本文同時提交且如下識別：2020年4月16日創建的名為“315514_ST25.txt,”的24千字節ACII(文本)文件。
技術介紹
[0004]胰島素是由雙鏈異源二聚體組成的肽激素，其通過酶處理從低效力單鏈胰島素原前體經生物合成得到。人胰島素由通過二硫鍵結合在一起并具有總共51個氨基酸(aa)的兩條肽鏈(“A鏈”(SEQ ID NO: 2)和“B鏈”(SEQ ID NO: 4))組成。A鏈和B鏈以三維結構締合以組裝接觸面，使得能夠高親和力結合胰島素受體。這些表面在受體結合時相對于游離激素部分重組。
[0005]胰島素及其類似物通過細胞進入顯示出降低血液中葡萄糖濃度的無可比擬的能力。事實上在所有形式的糖尿病(DM)中，血糖濃度的異常增加是關鍵問題。野生型(WT)人胰島素和其他動物胰島素分子(如在其他脊椎動物的基因組中編碼的)與多種器官和不同類型的細胞中的胰島素受體(IR)結合，而不考慮通過RNA剪接的替代模式產生的(稱為同種型A或B；IR
?>A或IR
?
B)且通過翻譯后糖基化的模式進一步精制(其可為組織特異性的)的受體同種型。WT人胰島素和其它動物胰島素的藥代動力學和藥效動力學(PK/PD)性質在患有DM的患者的亞組中常常是次優的。在過去三十年中，相關的未滿足的醫療需求導致了胰島素類似物的設計、開發和臨床應用(Sharma, A.K.等人, 2019)。胰島素類似物制劑的兩個主要類別是(i)比常規人胰島素制劑(N
?
rgaard, K.等人, 2018)從皮下貯庫更快速吸收的那些(且因此更速效)和(ii)比魚精蛋白相關的WT人胰島素的微晶懸浮液(Hompesch, M.等人, 2019)較不快速吸收(且因此更緩效和更持久)的那些。這些類別分別稱為餐時類似物制劑或基礎類似物制劑。
[0006]遺憾的是，目前臨床應用的餐時和基礎胰島素類似物制劑在室溫或高于室溫下一般比含有WT人胰島素的制劑，尤其是胰島素泵中使用的速效胰島素類似物制劑更易受化學和物理降解的影響(Woods, R.J.等人, 2012)。實際上，只有一種本領域已知的臨床胰島素類似物制劑表現出比WT胰島素(基礎產品Tresiba
?
；Novo
?
Nordisk)更大的保存期穩定性。因此，持續需要表現出增強的藥學性質的治療性胰島素類似物，比如在室溫或高于室溫下增加的熱力學穩定性和提高的對熱纖顫的抗性。
?
[Sanofi]的活性組分)。作為這些性質的結果，美國食品和藥品管理局已經對這種產品在室溫或高于室溫下的儲存和使用施加了限制。
[0011]為了減輕胰島素類似物制劑不穩定性，過去努力在胰島素的表面上采用常規的氨基酸取代，包括引入一個或多個跨越不參與受體結合的表面的其他二硫橋。這種表面取代或修飾的效用被受體結合性質或信號傳導性質中未預料和不期望的變化挫敗，比如在長期施用胰島素類似物時導致癌癥風險升高的促有絲分裂性增加(在B鏈表面上的穩定Asp
B10
取代的情況下)或異常延長的細胞信號傳導(在殘基B4和A10之間的工程改造化的二硫橋的情況下)。因此，其他二硫橋的效用被生物學性質中未預料和不期望的變化挫敗，比如一旦IR參與就延長的信號傳導，也引起對癌癥誘發的關注。由于胰島素核心的進化保守性和它結構的精巧性，在胰島素內部常規的氨基酸取代一般與降低的熱力學穩定性有關；據我們所知，尚未鑒定出這樣的具有增強的穩定性的核心取代。
[0012]由于在去折疊的自由能()和纖顫發生之前的滯后時間之間缺乏一致的關聯，發現防止纖顫的修飾的挑戰已被放大。本專利技術利用了硒代半胱氨酸相對于半胱氨酸(Sec對Cys；圖2A)獨特的物理化學性質。正如兩個Cys殘基可配對形成二硫橋(胱氨酸)，兩個Sec殘基可配對形成二硒橋(圖2B和2C)。本公開的一個令人驚訝的方面是，在速效胰島素類似物內部或在基礎胰島素類似物內部的殘基A6和A11中的硫原子被硒原子的成對取代應當增強穩定性并防止纖顫，而不改變受體結合親和力。胱氨酸A6
?
A11的位置示于圖3；描述胰島素纖顫途徑的機制示意圖示于圖4。因此，本公開從與本領域已知的氧化
?
還原化學的傳統看法不相關的角度看待硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸化學(Beld, J.等人, 2007, 2008, 2010)。
[0013]WT動物胰島素的基線不穩定性和它們在藥物制劑中對化學和物理降解的固有敏感性一般通過包含鋅離子來減輕，這促進Zn
2＋
?
配位的胰島素六聚體的天然組裝。這樣的六聚物在其內部含有兩個軸向鋅離子，并且表現出比無鋅胰島素溶液更大的穩定性。含鋅胰島素制劑一般比缺少鋅離子的對應制劑表現出保存期(Brange, J. (1987) in Galenics of insulin, Springer, Berlin, Germany [https://doi.org/10.1007/978
?3?
662
?
02526
?
0_3])。由于它們較低的熱力學穩定性和對纖顫增加的敏感性，目前臨床應用的某些胰島素類似物(比如賴脯胰島素和門冬胰島素)中的氨基酸取代加劇了對鋅離子的需求。因此，期望增強胰島素類似物的固有穩定性和它們對纖顫的抗性，使得藥物制劑可包含賦形劑，該賦形劑可有利地增強胰島素從皮下貯庫中吸收的速度或效率，但會與胰島素競爭鋅離子的結合。本領域已知的這種賦形劑的實例包括三磷酸鹽離子、三硫酸鹽離子和二價離子螯合劑，包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇
?
雙(β
?
氨基乙基醚)
?
N,N,N',N'
?
四乙酸(EGTA)。
[0014]因此，希望提供一類新的類別的速效和長效胰島素類似物，其單體結構在熱力學基礎上穩定，使得在構象折疊平衡中的全局去折疊最小化，并且使得近全局(subglobal)構象波動也被抑制。增強的穩定性和抑制的波動分別與降低的化學降解和物理降解速率相關，一起導致在室溫或高于室溫下延長的保存期。更一般地，需要一種穩定胰島素分子而不改變其受體結合表面的分子設計策略。
[0015]通過提供含有在位置A6和A11處半胱氨酸被硒代半胱氨酸(Sec)成對取代的胰島素類似物，申請人滿足了所述需求。后一氨基酸(其天然存在于人體中并被認為是“第21個
編碼的氨基酸”)含有單個原子取代：本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1. 一種胰島素類似物，其包含胰島素A鏈和胰島素B鏈，其中所述A鏈包含GIVEQX6CX8X9IX
11
SLYQLENYCX
21
?
R
53 (SEQ ID NO: 17)的序列；且所述B鏈包含序列FVX
23
QX
25
LCGX
29
X
30
LVX
33
X
34
LYLVCGX
41
X
42
GFX
45 (SEQ ID NO: 18)，其中X6為硒代半胱氨酸；X8為組氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸或色氨酸；X9為絲氨酸、賴氨酸或丙氨酸；X
11
為硒代半胱氨酸；X
21
選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸；X
23
為Asn或Lys；X
25
為組氨酸、精氨酸或蘇氨酸；X
29
選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；X
30
選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；X
33
選自天冬氨酸和谷氨酸；X
34
選自丙氨酸和蘇氨酸；X
41
選自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；X
42
選自丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸；X
45
為酪氨酸或苯丙氨酸；且R
53
為COOH或CONH2。2. 權利要求1所述的胰島素類似物，其中所述A鏈包含GIVEQX6CX8SIX
11
SLYQLENYCX
21
?
R
53 (SEQ ID NO: 15)的序列，且所述B鏈包含序列FVX
23
QX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX
48
X
49
X
50 (SEQ ID NO: 16)，其中X6為硒代半胱氨酸；X8為組氨酸、精氨酸或蘇氨酸；X
11
為硒代半胱氨酸；X
21
為丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X
23
為Asn或Lys；X
25
為組氨酸或蘇氨酸；X
48
為脯氨酸、賴氨酸或天冬氨酸；X
49
為脯氨酸、賴氨酸或甘氨酸；X
50
為蘇氨酸、丙氨酸或絲氨酸；且R
53
為COOH或CONH2。3. 權利要求1所述的胰島素類似物，其中B鏈序列包含序列FVKQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFF
?
R
63 (SEQ ID NO: 21)或FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFF
?
R
63 (SEQ ID NO: 20)，其中X
25
選自組氨酸和蘇氨酸；且R
63
選自YTX
28
KT (SEQ ID NO: 22)、YTKPT (SEQ ID NO: 23)、YTX
28
K (SEQ ID NO: 24)、YTKP (SEQ ID NO: 25)、YTPK (SEQ ID NO: 26)、YTX
28
、YT、Y和鍵，其中X
28
為脯氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。4. 權利要求3所述的胰島素類似物，其中B鏈序列包含序列FVKQX
25
LCGSHLVEALYLVCGE
RGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)、FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 27)、FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：N，
申請(專利權)人：耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司，
類型：發明
國別省市：
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