本文提供的是使用兩步擴增和分化方法產(chǎn)生自然殺傷(NK)細胞和NK祖細胞群體的方法。本文還提供的是使用三步擴增和分化方法產(chǎn)生NK細胞群體和NK祖細胞群體的方法。本文還提供的是使用通過本文描述的方法產(chǎn)生的NK細胞、NK細胞群體和NK祖細胞群體抑制腫瘤細胞增殖的方法，以及治療患有癌癥或病毒感染的個體的方法，包括將通過本文描述的方法產(chǎn)生的NK細胞、NK細胞群體和NK祖細胞群體給予患有所述癌癥或病毒感染的個體?；虿《靖腥镜膫€體。或病毒感染的個體。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
自然殺傷細胞及其用途
[0001]相關申請
[0002]本申請為2013年8月13日提交的、專利技術名稱為“自然殺傷細胞及其用途”、申請?zhí)枮?01380053349.5的中國專利技術專利申請的分案申請。
[0003]1.領域
[0004]本文提供的是由造血祖細胞群體產(chǎn)生自然殺傷(NK)細胞群體和NK祖細胞群體的方法，例如，由胎盤的細胞，例如由胎盤灌洗液(例如，人胎盤灌洗液)，例如胎盤來源的中間體NK細胞或其它組織(例如，臍帶血或外周血)產(chǎn)生NK細胞和NK祖細胞的方法。本文還提供的是通過本文所提供的方法產(chǎn)生的擴增的NK細胞群體，以及分離的NK細胞群體和NK祖細胞。本文進一步提供的是使用本文描述的胎盤灌洗液、NK細胞和/或NK祖細胞抑制腫瘤細胞增殖的方法。在某些實施方式中，將通過本文描述的方法產(chǎn)生的NK細胞和/或NK祖細胞與一種或多種免疫調節(jié)化合物(例如，本文中稱為的免疫調節(jié)化合物)組合使用和/或用所述一種或多種免疫調節(jié)化合物處理。
[0005]2.背景
[0006]自然殺傷(NK)細胞是構成先天性免疫系統(tǒng)的主要組分的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞不表達T
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細胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B細胞受體。NK細胞一般在人類中表達表面標志物CD16(FcγRIII)和CD56，但是人NK細胞的亞類為CD16
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。NK細胞是細胞毒性的；它們的細胞質中的小顆粒含有特殊的蛋白質，例如穿孔素(perforin)和被稱為顆粒酶的蛋白酶。一旦在要殺傷的靶向細胞附近釋放，則穿孔素在所述靶細胞的細胞膜中形成孔，顆粒酶及所締合的分子通過該孔可以進入，從而誘導細胞凋亡。一種顆粒酶，顆粒酶B(也稱為顆粒酶2和細胞毒性T
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淋巴細胞相關絲氨酸酯酶1)，是對于在細胞介導的免疫應答中快速誘導靶細胞凋亡來說至關重要的絲氨酸蛋白酶。
[0007]NK細胞對干擾素或者巨噬細胞源性細胞因子響應而被激活。激活的NK細胞有時被稱為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞，雖然LAK細胞通常為NK細胞、CD56+CD3+NK樣T細胞且可能為其它細胞毒性細胞的異質性群體。NK細胞的細胞毒性活性在很大程度上受兩種表面受體類型調節(jié)，所述受體可被視為“激活受體”或“抑制受體”，盡管有些受體，例如，CD94和2B4，可以視配體相互作用的方式不同而作用不同。
[0008]在其它活性中，NK細胞在宿主腫瘤排斥中起作用并且已顯示能夠殺死被病毒感染的細胞。改變或降低自身I類MHC表達水平的癌細胞導致誘導NK細胞敏感性。積累的臨床數(shù)據(jù)表明分離自外周血單核細胞(PBMC)或骨髓的人NK細胞的單倍同一性移植介導了強效的抗白血病效應而不會引起可檢測的移植物抗宿主病(GVHD)。參見Ruggeri等人,Science 295:2097
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2100(2002))。自然殺傷細胞可以通過細胞缺少或顯示出降低水平的主要組織相容性復合體(MHC)蛋白而被激活。另外，已知NK細胞上表達的激活受體介導了具有激活受體表達配體的“應激”或轉化細胞的檢測，并因此觸發(fā)了NK細胞活化。舉例來說，NCR1(NKp46)結合病毒血凝素。NKG2D配體包括CMV UL16
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結合蛋白1(ULB1)、ULB2、ULB3和MHC
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I類多肽相關序列A(MICA)和MICB蛋白。NK蛋白2B4結合CD48，并且DNAM
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1結合脊髓灰質炎病毒受體(PVR)和粘連蛋白
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2(Nectin
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2)，兩者均在急性髓樣白血病(AML)中持續(xù)檢測到。參見Penda
等人,Blood 105:2066
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2073(2004)。此外，已描述AML的溶胞主要是天然細胞毒性受體(NCR)依賴性的。參見Fauriat等人,Blood 109:323
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330(2007)。激活并擴增的來源于外周血的NK細胞且在有些情況下是LAK細胞已在晚期癌癥患者的離體療法(ex vivo therapy)和體內治療(in vivo treatment)中使用，其中對骨髓相關疾病，如白血病、乳癌和某些類型的淋巴瘤，取得了一定的成功。NK細胞治療或在有些情形下是LAK細胞治療需要患者首先接受IL
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2，隨后進行白細胞去除術和過繼轉移(adoptive transfer)。在有些情形下，在過繼轉移之前還將所收獲的自體血細胞在存在IL
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2的情況下離體孵育和培養(yǎng)幾天。必須將NK細胞或在有些情形下是LAK細胞與相對高劑量的IL
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2一起再輸注以完成所述療法。這種凈化治療(purging treatment)是昂貴的并且可引起嚴重的副作用。這些包括體液潴留、肺水腫、血壓降低和高燒。
[0009]雖然NK細胞在殺死腫瘤細胞和病毒感染的細胞中具有有利性能，但是它們仍難以與免疫療法一起使用和在免疫療法中應用，這主要是由于在培養(yǎng)和擴增期間難以維持它們的腫瘤靶向和殺腫瘤能力。因此，本領域需要開發(fā)產(chǎn)生并且擴增保留殺腫瘤功能的自然殺傷細胞的有效方法。
[0010]3.概述
[0011]本文提供的是擴增并且分化細胞(例如，造血細胞，例如造血干細胞，例如CD34
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造血干細胞)以產(chǎn)生自然殺傷(NK)細胞和NK祖細胞的方法。
[0012]在一個方面，本文提供的是產(chǎn)生NK細胞的方法，包括在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細胞或祖細胞(例如，CD34
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干細胞或祖細胞)以產(chǎn)生擴增并且分化的細胞(例如，如通過細胞的祖先狀態(tài)喪失和/或CD34表達喪失所證明的分化)，并隨后在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述擴增的細胞，其中所述細胞進一步擴增并分化成自然殺傷細胞。該第一步驟和第二步驟包括在含有細胞因子的獨特組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。一般而言，第一步驟中使用的培養(yǎng)基與第二步驟中使用的培養(yǎng)基不相同。在某些實施方式中，所述細胞的因子(例如，細胞因子)不包含在培養(yǎng)基的不明確的組分(例如，血清)中，舉例來說，所述細胞的因子(例如，細胞因子，例如特定濃度的細胞因子)對于培養(yǎng)基的不明確的組分(例如，血清)來說是外源的。在某些實施方式中，所述方法是兩步方法。在某些實施方式中，將第二步驟的培養(yǎng)基加入到來自第一步驟的細胞培養(yǎng)物中而無需改變來自第一步驟的培養(yǎng)基。在某些實施方式中，所述方法不包括其中接觸(或培養(yǎng))細胞的任何第三步驟或中間步驟。通過使用這兩個步驟(例如，兩步方法)的本文提供的方法產(chǎn)生的自然殺傷細胞在本文中被稱為TSNK細胞。
[0013]在一個具體的實施方式中，本文提供的是產(chǎn)生激活的自然殺傷(NK)細胞群體的方法，其包括：(a)將造血干細胞或祖細胞群體接種到包含外源白介素
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15(IL
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15)并可選地包含干細胞因子(SCF)和白介素
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7(IL
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7)中的一種或兩種的第一培養(yǎng)基中，其中所述外源IL
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15和可選的SCF和IL本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.分離的自然殺傷(NK)祖細胞群體，其中所述NK祖細胞按照以下方法產(chǎn)生：(i)在包含F(xiàn)lt3L、TPO、SCF、IL
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7、G
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CSF、IL
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6和GM
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CSF的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細胞或祖細胞，(ii)隨后在包含F(xiàn)lt3L、SCF、IL
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15和IL
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7、IL
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17和IL
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15、G
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CSF、IL
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6和GM
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CSF的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞，和(iii)隨后在包含SCF、IL
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15、IL
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7、IL
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2、G
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CSF、IL
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6和GM
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CSF的第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。2.權利要求1的分離的NK祖細胞群體，其中培養(yǎng)步驟(i)的持續(xù)時間為7
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9天，其中培養(yǎng)步驟(ii)的持續(xù)時間為5
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7天，和其中培養(yǎng)步驟(iii)的持續(xù)時間為5
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9天。3.權利要求1的分離的NK祖細胞群體，其中培養(yǎng)步驟(i)的持續(xù)時間為7
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9天，其中培養(yǎng)步驟(ii)的持續(xù)時間為5
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7天，和其中培養(yǎng)步驟(iii)的持續(xù)時間為21
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35天。4.權利要求1、2或3的分離的NK祖細胞群體，其中所述方法中使用的造血干細胞或祖細胞是CD34
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。5.權利要求1、2或3的分離的NK祖細胞群體，...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：埃里克，
申請(專利權)人：人類起源公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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