一種適用于特異感染U251細胞的腺相關病毒突變體制造技術

本發明專利技術提供了一種適用于特異感染U251細胞的腺相關病毒突變體。本發明專利技術利用AAV2/2的肽段突變文庫，通過文庫篩選獲得可高效、特異感染U251的AAV血清型突變體。通過體外殺傷實驗證實：本發明專利技術篩選得到的AAV血清型突變體能夠特異性的感染和殺傷U251細胞，在體外研究膠質瘤發生發展的機理及膠質瘤治療藥物的開發方面有廣泛的應用。面有廣泛的應用。面有廣泛的應用。

【技術實現步驟摘要】
一種適用于特異感染U251細胞的腺相關病毒突變體


[0001]本專利技術病毒載體的包裝及篩選，尤其涉及AAV突變體的包裝及篩選。

技術介紹

[0002]神經腦膠質細胞瘤(Glioma)是中樞神經系統常見的原發性惡性腦瘤，具有復發性高、 預后效果差、患者的死亡率高等特性，是目前最致命的腫瘤之一。目前對于膠質瘤還沒有 特別有效的治療策略，現有核心的治療手段仍然是對瘤體進行常規的最大范圍內切除手術， 以及放射治療和化學治療等。但由于腦膠質瘤惡性浸潤性生長等特性，常規手術和化療放 療法只能極少地改善生活質量并略微延長一些患者的生存期，對于腦膠質瘤確診后的五年 生存率并沒有明顯改善，且易復發。
[0003]腺相關病毒(adeno
?
associated virus,AAV)是一類微小、無被膜及具有二十面體結 構的病毒，是目前被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗 研究中得到廣泛應用。
[0004]U251人神經膠質細胞瘤細胞，該細胞系常被用作腦膠質瘤體外研究的工具模型，在此 細胞系上進行相關的機理研究和治療效果檢測。但此細胞轉染效率不高，用腺相關病毒AAV 感染效率較低，且目前尚未有特異感染的血清型。現有的AAV血清型(AAV2/2)感染膠質 瘤細胞系(U251)效率低，且特異差，在相同的MOI(感染復數)下，對常用的工具細胞(293T 和NIH3T3)的感染效果更好。為了更好地在體外對膠質瘤細胞模型(U251)進行相關的研 究，并將腺相關病毒應用于膠質瘤的治療中，我們利用AAV2/2的肽段突變文庫，通過文庫 篩選獲得可高效、特異感染U251的AAV血清型突變體，為體外研究膠質瘤發生發展的機理 及膠質瘤治療藥物的開發提供了一種強大的工具。

技術實現思路

[0005]針對現有技術中的缺陷，為了更好地在體外對膠質瘤細胞模型(U251)進行相關的研 究，并將腺相關病毒應用于膠質瘤的治療中，本專利技術利用AAV2/2的肽段突變文庫，通過文 庫篩選獲得可高效、特異感染U251的AAV血清型突變體，為體外研究膠質瘤發生發展的機 理及膠質瘤治療藥物的開發提供了一種強大的工具。
[0006]本專利技術公開了一種異源肽，其特征在于，所述異源肽為：
[0007](a)氨基酸序列為ARLDITD或YHAFNIE所組成的多肽；
[0008](b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異源肽活 性的由(a)衍生出的多肽。
[0009]本專利技術還公開了定點突變的AAV2/2衣殼蛋白，其特征在于，所述衣殼蛋白氨基酸587～ 588之間被所述的異源肽插入。
[0010]本專利技術公開了AAV2/2血清型突變體，其特征在于，包括所述的衣殼蛋白。
[0011]本專利技術公開了一種核酸分子，其特征在于，編碼所述的衣殼蛋白或所述的突變體。
[0012]本專利技術公開了一種核酸載體，其可操作地連接有所述的核酸分子。
[0013]本專利技術提供了一種宿主細胞，其特征在于，含有所述的核酸載體。
[0014]本專利技術提供了一種組合物或試劑盒，含有所述的衣殼蛋白或3所述的突變體或所述的 核酸分子或所述的核酸載體。
[0015]本專利技術還公開了所述的衣殼蛋白或所述的突變體或所述的核酸分子或所述的核酸載體 在用于制備治療腫瘤的藥物中的用途。進一步地，所述腫瘤為人神經膠質細胞瘤。
[0016]本專利技術公開了所述的突變體或所述的衣殼蛋白或所述的核酸分子或所述的核酸載體在 用于感染和/或殺傷U251細胞的用途。
[0017]與現有技術相比，本專利技術有如下有益效果：
[0018](1)本專利技術所述的AAV血清型突變體能夠特異性地感染U251細胞，而野生對照組感 染U251細胞的效果差，感染293T細胞的效果好；
[0019](2)體外殺傷實驗證明，本專利技術所述的AAV血清型突變體對U251有明顯的殺傷，而 對293T的殺傷則不明顯，表明其能特異性感染U251細胞；
[0020](3)體內殺傷實驗證實，本專利技術所述的AAV血清型突變體對腫瘤的抑制作用較對照組 更加顯著，具備被開發為抗腫瘤藥物的前景。
附圖說明
[0021]圖1為實施例1中pAAV
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short UBC
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mScarlet
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polyA
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P40
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AAV2
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Cap
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FLEX
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SV40 polyA 結構圖；
[0022]圖2為實施例2中文庫病毒感染U251細胞的熒光圖；
[0023]圖3為突變血清型與AAV2病毒感染細胞的熒光圖；
[0024]圖4為突變血清型與AAV2病毒感染293T和U251的熒光圖；
[0025]圖5為突變血清型與AAV2病毒感染293T和U251的殺傷實驗結果統計圖；
[0026]圖6突變血清型與AAV2病毒體內殺傷瘤體體積曲線圖。
[0027]圖7為本專利技術實施例3中穿梭載體pAAV
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CAG
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mCherry
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WPRE載體圖譜；
[0028]圖8為本專利技術實施例4中pAAV
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SV40增強子
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hTERT
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EGFP載體圖譜；
[0029]圖9為本專利技術實施例4中pAAV
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SV40增強子
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hTERT
?
TK載體圖譜。
具體實施方式
[0030]下面通過實施例的方式進一步說明本專利技術，但并不因此將本專利技術限制在所述的實施例 范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品 說明書選擇。
[0031]突變位點的選擇：AAV2/2衣殼蛋白氨基酸587～588之間。
[0032]我們突變的位點是基于AAV2/2的血清型，野生型AAV2/2衣殼蛋白序列來自的NCBI號 為：NC_001401。
[0033][0034]實施例1肽段突變體文庫制備
[0035]1.1化學合成AAV2/2
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7mer
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NNS以下兩個片段：
[0036]5'GGTCTCGCCTCCAGAGAGGCAACNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSAGACAAGCAGCTACCGGGAGACC 3' (SEQ ID NO:1)
[0037]5'GGTCTCCCGGTAGCTGCTTGTCTSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNGTTGCCTCTCTGGAGGCGAGACC 3' (SEQ ID NO:2)
[0038]1.2將合成的AAV2/2
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7mer
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NNS正鏈與反鏈引物各加10μL(引物的終濃度為10mM) 采用退火的方式來獲本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種異源肽，其特征在于，所述異源肽為：(a)氨基酸序列為ARLDITD或YHAFNIE所組成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異源肽活性的由(a)衍生出的多肽。2.定點突變的AAV2/2衣殼蛋白，其特征在于，所述衣殼蛋白氨基酸587～588之間被權利要求1所述的異源肽插入。3.AAV2/2血清型突變體，其特征在于，包括權利要求2所述的衣殼蛋白。4.核酸分子，其特征在于，編碼權利要求2所述的衣殼蛋白或權利要求3所述的突變體。5.核酸載體，其可操作地連接有權利要求4所述的核酸分子。6....

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊興林，楊佳麗，潘謳東，高花，祝翊倩，
申請(專利權)人：和元生物技術上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：