本發明專利技術涉及微生物技術技術領域，具體公開了一種牛樟芝共生真菌AcEF007及其分離方法，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具體的保藏編號為CCTCC NO:M 20211093，本發明專利技術所保護的樟芝共生真菌AcEF007，通過分離篩選牛樟芝的共生菌而得到。通過抗菌活性實驗發現，AcEF007菌液體提取物對肺炎克雷伯菌、銅尿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、溶血性葡萄球菌等細菌具有較好的抗細菌活性，本發明專利技術對多種致病細菌有較好的抑制作用，為緩解致病菌耐藥性對人類健康構成的威脅，研究開發新的抗細菌藥物提供新的途徑。研究開發新的抗細菌藥物提供新的途徑。
【技術實現步驟摘要】
牛樟芝共生真菌AcEF007及其分離方法
[0001]本專利技術涉及微生物技術
，具體涉及一種牛樟芝共生真菌AcEF007 及其分離方法。
技術介紹
[0002]目前從天然產物中篩選生物活性成分或藥物先導化合物是研究創制新藥的有效途徑之一，微生物是新的天然產物的重要來源，其次生代謝產物是通過多種生物合成和代謝途徑而形成。植物內生菌一類侵入植物組織內部生長，但不給宿主造成明顯負效應的微生物，在長期共進化過程中，共生菌與宿主植物形成了特殊的生理代謝途徑，產生出各種結構的活性化合物，可以幫助宿主增強對昆蟲，疾病，干旱，植物病原菌等的抵抗能力，因此研究共生菌的次生代謝產物，對我們開發新的抗菌藥物有重要的作用。
[0003]通過長期的自然演變，病原微生物與各物種之間建立了復雜的拮抗或共生關系，不僅能引起某些特定疾病，還可作為條件致病菌，在宿主免疫力低下、機體屏障功能被破壞時發生菌群失調或細菌移位，造成機體的嚴重感染。為了殺死病菌或者抑制病菌活性，人們專利技術了抗生素和合成抗菌藥物，隨著抗菌藥物的廣泛應用，致病細菌對抗生素產生耐藥性，甚至出現了多重耐藥性，致病菌耐藥性的發生和蔓延已構成對人類健康的嚴重威脅。基于市場和研究的需要，尋找抗菌活性強、可高效利用的新生物資源成為研究的重點。
[0004]已有研究表明在植物內生真菌代謝產物中常發現與其宿主植物活性成分相似或相同的活性物質，其中部分物質為抗菌類物質，在苦楝、丹參、鐵皮石斛、元寶草等多種植物共生菌中發現了具有抗細菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物質。牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是臺灣特有珍稀藥用真菌，寄生在野生牛樟 (Cinnamomum kanehirai)腐朽的樹干心材內壁或倒伏的樹干潮濕表面，含萜類、多糖、固醇類及脂肪酸等多種生理活性物質，其有效成分具有抗癌、消炎等作用。
[0005]通過研究并分離得到具體的活性菌種，有利于醫藥產業的進一步發展。
技術實現思路
[0006]本專利技術的主要目的是提供一種牛樟芝共生真菌AcEF007及其分離方法，通過本專利技術獲得的牛樟芝共生真菌AcEF007及其培養物或加工物，具有廣泛的抗菌、消炎效果，為研究開發新的抗細菌藥物提供新的途徑。
[0007]為達到以上目的，本專利技術提供了以下技術方案：
[0008]牛樟芝共生真菌AcEF007，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0009]進一步地，牛樟芝共生真菌AcEF007(phoma.sp)的保藏編號為CCTCC NO:M20211093，保藏名稱為莖點霉屬phoma.sp；保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址是中國武漢大學；該培養物于2021年8月27日由該保藏中心收到，并登記入冊，該培養物的存活性由保藏中心于2021年9月11日檢測，且測定結果為存活。
[0010]進一步的，本專利技術提供了一種分離牛樟芝共生真菌AcEF007的方法，包括以下步驟：
[0011](1)先用自來水沖洗牛樟芝子實體36h，然后轉入無菌工作臺，再用3L無菌水沖洗清子實體；
[0012](2)用滅菌小刀取子實體，放入離心管中，加入超純水，然后在細胞破碎勻漿機中震蕩破碎，將破碎液按十分之一、百分之一、千分之一、萬分之一進行稀釋，取稀釋后的子實體懸浮液涂抹在MYKAS抗細菌培養基上，將接好的培養基放置于26℃恒溫培養箱中培養；
[0013](3)待培養基中長出的菌絲，在顯微鏡下把長出的菌絲轉接的到MY培養基上培養，持續觀察10d后，將所挑取的菌株進行后續分子鑒定后得到牛樟芝共生真菌AcEF007。
[0014]進一步地，本專利技術提供了制備AcEF007的發酵液提取物方法，包括以下步驟：
[0015](1)加入1000ul的PG液體到2ml的離心管中，并在每個離心管放3顆滅菌好的鋼珠，然后將已長成型的牛樟芝共生真菌AcEF007菌絲體刮取適量放入離心管，破碎90S，然后將破碎液分別接種500ul到每個裝有PG液體培養基的錐形瓶中，置于28℃，轉速為150r
·
min
?1的搖床中培養8d；
[0016](2)培養物菌絲體提取，發酵培養完成后，得到牛樟芝共生真菌AcEF007菌絲體及培養液，用分液漏斗將菌絲體和菌液分離，并在菌液中加入乙酸乙酯搖勻 6min，超聲30min后靜置12h，將分層的下層廢液回收，上層萃取溶液用旋轉蒸發儀冷凝回流干燥，獲得牛樟芝共生真菌AcEF007培養的發酵液提取物。
[0017]優選的，所述步驟(2)中，于菌液中按照體積比1:1加入乙酸乙酯。
[0018]優選的，所述PG液體培養基包括如下組分：馬鈴薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，維生素B
1 0.1g/L。
[0019]本專利技術利用牛樟芝篩選技術方案，分離篩選牛樟芝的共生菌，并對其進行抗菌活性檢測，獲取菌絲體所產生的抗菌活性化合物，得到一株具有抗菌活性的真菌AcEF007。通過抗菌活性實驗發現，AcEF007菌液體提取物對肺炎克雷伯菌、銅尿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、溶血性葡萄球菌等細菌具有較好的抗細菌活性，本專利技術對多種致病細菌有較好的抑制作用，為緩解致病菌耐藥性對人類健康構成的威脅，研究開發新的抗細菌藥物提供新的途徑。
[0020]本專利技術獲得的真菌AcEF007在MY培養基上生長良好，菌落表面呈絨毛狀，生長前期菌絲是白色呈放射狀向周圍生長，生長后期菌絲較密集，且菌層較厚，顏色微微泛紅，菌落呈規則的圓形狀，具有特殊的生物性狀，現有的同種群菌未發現與本專利技術具有同樣性狀的，該菌具有優越的抑菌性能。
附圖說明
[0021]圖1為本專利技術所述的AcEF007菌絲生長情況圖；
[0022]圖2為本專利技術AcEF007熒光顯微鏡下菌絲體圖；
[0023]圖3為本專利技術的AcEF007對肺炎克雷伯菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組， d表示實驗組；
[0024]圖4為本專利技術的AcEF007對銅尿假單胞菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組， d表示實驗組；
[0025]圖5為本專利技術的AcEF007對金黃色葡萄球菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組，d表示實驗組；
[0026]圖6為本專利技術的AcEF007對大腸埃希菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組，d 表示實驗組；
[0027]圖7為本專利技術的AcEF007對鮑曼不動桿菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組， d表示實驗組；
[0028]圖8為本專利技術的AcEF007對溶血性葡萄球菌的抑制作用圖，a、b、c表示對照組，d表示實驗組；
[0029]圖9本專利技術基于ITS構建了牛樟芝共生真菌AcEF007的系統發育樹顯示圖。
具體實施方式
[0030]下面本專利技術結合附圖和具體實施例作進一步說明，本專利技術中使用的化學物均為分析純級本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.牛樟芝共生真菌AcEF007，其特征在于，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.根據權利要求1所述的牛樟芝共生真菌AcEF007，其特征在于，所述共生真菌AcEF007(phoma.sp)的保藏編號為CCTCC NO:M 20211093。3.根據權利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的培養物或其加工物。4.一種根據權利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007在制備抗細菌藥物中的應用。5.一種菌劑，其特征在于，含有權利要求3所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的培養物或其加工物。6.根據權利要求5所述的一種菌劑，其特征在于，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一種：(a)牛樟芝共生真菌AcEF007的發酵液提取物；(b)牛樟芝共生真菌AcEF007細胞的超聲裂解上清；(c)牛樟芝共生真菌AcEF007細胞的超聲裂解沉淀。7.一種分離權利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)先用自來水沖洗牛樟芝子實體36h，然后轉入無菌工作臺，再用3L無菌水沖洗清子實體；(2)用滅菌小刀取子實體，放入離心管中，加入超純水，然后在細胞破碎勻漿機中震蕩破碎，將破碎液進行稀釋，取稀釋后的子實體懸浮液涂抹在MYKAS抗細菌培養基上，將接好的培養基放置于26℃恒溫培養箱中培養；(3)待培養基中長出的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王毅，鄭元，楊宇明，
申請(專利權)人：鄭元，
類型：發明
國別省市：
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