精子質量多參數檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種精子質量多參數檢測試劑盒，包括：偶聯有熒光標記物的Annexin V復合物、溴化乙錠染料、吖啶橙染料、酸化液和緩沖液；所述熒光標記物為可在波長為200

【技術實現步驟摘要】
精子質量多參數檢測試劑盒


[0001]本專利技術涉及領域，特別涉及一種精子質量多參數檢測試劑盒。

技術介紹

[0002]當前，不孕不育的發病率呈現逐年升高的趨勢，傳統的精液常規分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標。精子活率、精子DNA的完整性、精子ROS水平等參數被廣泛用作精子質量評價的指標。DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，所以精子DNA完整性對精子細胞至關重要。
[0003]現今，DNA完整性檢測通常采用基于吖啶橙熒光染色原理的精子染色質結構檢測(SCSA)法，其原理為：正常染色質的精子保持完整的DNA雙鏈結構，雙鏈DNA與吖啶橙結合會發出綠色熒光；異常染色質的精子易受算變性成單鏈DNA，單鏈DNA與吖啶橙結合會發出紅色熒光，從而通過流式細胞儀采集紅色和綠色熒光即可計算出DNA碎片率。細胞死亡可表征為：細胞壞死和細胞凋亡，細胞壞死情況下，細胞膜完整性收到破壞，細胞的選擇透性功能散失；細胞凋亡，在凋亡早、中期，細胞膜保持完整性。吖啶橙染料能透過壞死和凋亡細胞的細胞膜，對所有細胞中的染色質進行染色，所以，SCSA檢測的是所有精子細胞(精子活細胞、壞死細胞、凋亡細胞)的DNA碎片率。例如專利CN102051413A公開的一種人類精子DNA碎片檢測方法及檢測試劑盒。
[0004]溴化乙錠染料只能夠進入細胞膜受損的壞死細胞，對DNA進行染色，能發出橙紅色熒光，所以通過溴化乙錠染料染色可以檢測出細胞膜受損的壞死細胞。由于溴化乙錠染料不能進入細胞膜保持完整的凋亡細胞中，可見現有技術中的吖啶橙染料與溴化乙錠染料結合使用進行流式細胞儀檢測時，細胞膜保持完整的早、中期凋亡細胞仍然處于灰色地帶，無法被檢出，導致計算出的DNA碎片率為凋亡細胞和活細胞的總體DNA碎片率，與真正需要的活細胞中的DNA碎片率指標存在一定的統計學差異。
[0005]另一方面，精子ROS水平也能在一定程度上反應精子質量，目前通常需要采用專門的活性氧檢測試劑盒實現ROS測定，例如，專利CN108593393A公開的精子活性氧染色試劑盒及其使用方法。所以現有技術中還無法實現精子DNA碎片率和ROS水平的同時檢測。
[0006]所以，現在有必要提供一種更可靠的方案。

技術實現思路

[0007]本專利技術所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種精子質量多參數檢測試劑盒。
[0008]為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案是：一種精子質量多參數檢測試劑盒，包括：偶聯有熒光標記物的Annexin V復合物、溴化乙錠染料、吖啶橙染料、酸化液和緩沖液；所述熒光標記物為可在波長為200
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400nm的激發光的激發下產生綠色熒光的碳量子點。
[0009]優選的是，所述碳量子點通過以下方法制備得到：
[0010]1?
1)將番茄紅素、二硫蘇糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，再加入乙二胺，攪拌；
[0011]1?
2)將步驟1
?
1)得到的溶液轉移到反應釜中，加熱反應；
[0012]1?
3)反應結束后，將產物過濾，濾液干燥得到粗產品；
[0013]1?
4)將粗產品溶于超純水中，離心，將離心液透析，收集透析袋內溶液，冷凍干燥，即得所述碳量子點。
[0014]優選的是，所述碳量子點通過以下方法制備得到：
[0015]1?
1)將番茄紅素、二硫蘇糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超聲攪拌至澄清，再加入乙二胺，攪拌1
?
3分鐘；
[0016]1?
2)將步驟1
?
1)得到的溶液轉移到聚四氟乙烯為內襯的反應釜中，在烘箱中加熱至130℃
?
160℃下持續反應4
?
12小時；
[0017]1?
3)反應結束后，待產物冷卻至室溫，再用濾膜過濾產物，將濾液冷凍干燥得到粗產品；
[0018]1?
4)將粗產品溶于超純水中，離心，取濾液用截斷分子量為800
?
1500Da的透析袋透析8
?
16小時，收集透析袋內溶液，冷凍干燥，即得所述碳量子點。
[0019]優選的是，其中，偶聯有熒光化合物的Annexin V復合物通過以下方法制備得到：
[0020]2?
1)將碳量子點加入到PBS緩沖液中，攪拌溶解，然后加入EDC和NHS，活化；
[0021]2?
2)將Annexin V試劑加入到步驟2
?
1)得到的溶液中，37℃下搖床反應，反應產物純化后得到該Annexin V復合物溶液。
[0022]優選的是，其中，偶聯有熒光化合物的Annexin V復合物通過以下方法制備得到：
[0023]2?
1)將10mg碳量子點加入到10mLPBS緩沖液中，攪拌溶解，然后加入200μL濃度為2mg/mL的EDC和60μL濃度為2mg/mL的NHS，30℃下活化20min；
[0024]2?
2)將20mg Annexin V試劑加入到步驟2
?
1)得到的溶液中，37℃下搖床反應18小時，反應產物純化后得到該Annexin V復合物溶液。
[0025]優選的是，其中，所述酸化液包括：0.05
?
0.2mol/L的鹽酸、0.1
?
0.5mol/L的氯化鈉、質量分數0.02
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0.2％的曲拉通X
?
100；
[0026]所述緩沖液包括：0.1
?
0.5mol/L的氯化鈉、0.2
?
2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.01
?
0.05mol/L十二烷基肌氨酸鈉、0.05
?
0.2mol/L檸檬酸和0.1
?
0.5mol/L磷酸氫二鈉。
[0027]優選的是，該試劑盒還包括RNA酶液，RNA酶液的pH值為7.4；該RNA酶液包括：10
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100mg/mL的RNase A、50mmol/L的Tris
?
HCL、體積百分比為40
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60％的甘油以及0.1mol/L的KCl。
[0028]優選的是，使用該試劑盒對精子質量進行檢測的方法包括以下步驟：
[0029]S1、用緩沖液將精子樣品稀釋，得到精子稀釋液；
[0030]S2、將Annexin V復合物溶液加入到步驟S1得到溶液中，混勻后孵育；
[0031]S3、向步驟S2得到的混合物中加入溴化乙錠染料，混勻后孵育；
[0032]S4、向步驟S3得到的產物中加入緩沖液，混勻，然后加入酸化液，處理10
?
60秒后加入吖啶橙染料，混勻得到待測試樣；
[0033]S5、利用流式細胞儀對待測試樣進行檢測，收集待測試樣的藍色、橙紅色、綠色和紅色熒光；
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種精子質量多參數檢測試劑盒，其特征在于，包括：偶聯有熒光標記物的Annexin V復合物、溴化乙錠染料、吖啶橙染料、酸化液和緩沖液；所述熒光標記物為可在波長為200
?
400nm的激發光的激發下產生綠色熒光的碳量子點。2.根據權利要求1所述的精子質量多參數檢測試劑盒，其特征在于，所述碳量子點通過以下方法制備得到：1
?
1)將番茄紅素、二硫蘇糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，再加入乙二胺，攪拌；1
?
2)將步驟1
?
1)得到的溶液轉移到反應釜中，加熱反應；1
?
3)反應結束后，將產物過濾，濾液干燥得到粗產品；1
?
4)將粗產品溶于超純水中，離心，將離心液透析，收集透析袋內溶液，冷凍干燥，即得所述碳量子點。3.根據權利要求2所述的精子質量多參數檢測試劑盒，其特征在于，所述碳量子點通過以下方法制備得到：1
?
1)將番茄紅素、二硫蘇糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超聲攪拌至澄清，再加入乙二胺，攪拌1
?
3分鐘；1
?
2)將步驟1
?
1)得到的溶液轉移到聚四氟乙烯為內襯的反應釜中，在烘箱中加熱至130℃
?
160℃下持續反應4
?
12小時；1
?
3)反應結束后，待產物冷卻至室溫，再用濾膜過濾產物，將濾液冷凍干燥得到粗產品；1
?
4)將粗產品溶于超純水中，離心，取濾液用截斷分子量為800
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1500Da的透析袋透析8
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16小時，收集透析袋內溶液，冷凍干燥，即得所述碳量子點。4.根據權利要求3所述的精子質量多參數檢測試劑盒，其特征在于，其中，偶聯有熒光化合物的Annexin V復合物通過以下方法制備得到：2
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1)將碳量子點加入到PBS緩沖液中，攪拌溶解，然后加入EDC和NHS，活化；2
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2)將Annexin V試劑加入到步驟2
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1)得到的溶液中，37℃下搖床反應，反應產物純化后得到該Annexin V復合物溶液。5.根據權利要求1所述的精子質量多參數檢測試劑盒，其特征在于，其中，偶聯有熒光化合物的Annexin V復合物通過以下方法制備得到：2
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1)將10mg碳量子點加入到10mLPBS緩沖液中，攪拌溶解，然后加入200μL濃度為2mg/mL的EDC和60μL濃度為2mg/mL的NHS，30℃下活化20min；2
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2)將20mg Annexin V試劑加入到步驟2
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【專利技術屬性】
技術研發人員：田晶晶，吳紅波，胡佳，
申請(專利權)人：浙江大學蘇州工業技術研究院，
類型：發明
國別省市：