一種抗性HPPD基因的克隆表達的方法技術

本發明專利技術的抗性HPPD基因的克隆表達的方法，包括以下步驟：步驟一：對表層土壤和下水道污泥的進行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培養基中，在30℃，180r/m富集培養5d，得到培養物。通過臨床試驗表明，通過本方法可以較好的獲取自然界中已有以及轉基因植物中突變產生的各類有效的基因資源，并從中可以較快的篩選出適用于除草劑使用的基因序列以及克隆表達，從而為新型除草劑的研發奠定了基礎。除草劑的研發奠定了基礎。除草劑的研發奠定了基礎。

【技術實現步驟摘要】
一種抗性HPPD基因的克隆表達的方法


[0001]本專利技術涉及硝磺草酮
，具體涉及一種抗性HPPD基因的克隆表達的方法。

技術介紹

[0002]草甘膦和抗草甘膦作物的組合在農作物轉基因領域超過20年的大面積持續應用，對全球范圍農田雜草的控制起到了非常大的作用。然而，長期高劑量使用草甘膦造成了嚴重的環境危害和巨大的選擇壓力，已經導致了40多種雜草對草甘膦產生了抗藥性。草甘膦及其抗性基因替代組合的發掘和應用，是植物轉基因領域重要且緊迫的研究任務之一。
[0003]研發替代草甘膦的轉基因作物靶標除草劑近些年取得了顯著的成績，其中巴斯夫和先正達利用來自于燕麥的HPPD突變體AvHPPD
?
03開發出抗硝磺草酮的轉基因大豆SYHT0H2并已進行了商業化生產。而國內關于該領域的研究較好，且取得的成果也遠遠不如國外。其中HPPD抑制劑類除草劑主要品種有硝磺草酮、苯吡唑草酮和異噁唑草酮，硝磺草酮是用量最大的一類。目前，國內僅克隆出了3個抗HPPD基因，尚無高抗硝磺草酮的HPPD基因的報道。
[0004]造成該情況的主要原因是國內在抗HPPD基因的克隆表達方面存在短板，且稍微提出較好的解決方法。而在實際使用中，4
?
羥基苯丙酮酸雙加氧酶抑制劑類除草劑是近年來新開發的一類新型白化型除草劑，其除草機理是通過競爭性抑制植物酪氨酸代謝途徑中HPPD的活性，從而使質體醌和生育酚的合成受阻，間接影響了類胡蘿卜素的合成和功能，使植物光合作用不能正常進行，導致雜草葉片白化，組織壞死，最終死亡。HPPD抑制劑類除草劑廣泛應用于防治玉米田中的闊葉雜草和禾本科雜草，具有環境安全性高、作物安全性好和雜草抗性產生慢等顯著優點，具有很好的市場前景和商業價值。
[0005]基于此，開發一種用于抗性HPPD基因的克隆表達方式的方法，并進行標準化、規范化流程指導，對現有HPPD抑制劑類除草劑的研發具有重要的意義。

技術實現思路

[0006]本專利技術的目的在于提供一種抗性HPPD基因的克隆表達的方法，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。
[0007]為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
[0008]抗性HPPD基因的克隆表達的方法，包括以下步驟：
[0009]步驟一：對表層土壤和下水道污泥的進行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培養基中，在30℃，180r/m富集培養5d，得到培養物；
[0010]步驟二：采用SDS
?
高鹽法提取抗性菌株基因組DNA，根據16S rRNA基因通用引物27F/1492R中進行序列比對，下載同源性高的模式菌株的16SrRNA基因序列，在MEGA6.0軟件中，利用鄰接法構建進化樹；
[0011]步驟三：根據同屬的Stenotrophomonas indicatrix WS40T的hppd基因序列，設計引物對Sthppd
?
F/Sthppd
?
R，以菌株MST
?
5基因組DNA為模板，PCR擴增Sthppd基因，并克隆到
pMD18
?
T載體上，然后轉化至E.coli DH5a中，提取陽性克隆子的質粒并對Sthppd基因進行測序，通過NCBI數據庫中BLASTN和BLASTP對獲得的Sthppd基因序列進行核酸和蛋白序列的比對分析；
[0012]步驟四：最后再進行克隆表達處理。
[0013]優選地，所述根據16S rRNA基因通用引物27F/1492R的具體操作為：PCR擴增抗性菌株的16S rRNA基因序列，PCR產物TA克隆至pMD18
?
T載體，轉化至Escherichia coli DH5a，提取陽性克隆子質粒并委托上海生工進行測序，得到的抗性菌株的16S rRNA基因序列提交到在線網站EzBioCloud上。
[0014]優選地，所述抗性菌株克隆表達的具體步驟為：在Stenotrophomonas indicatrix WS40T氨基酸序列文庫中，通過同源序列比對找到其HPPD以及對應的hppd基因，并以此設計引物對Sthppd
?
F和Sthppd
?
R，以菌株MST
?
5基因組DNA為模板，利用PCR成功擴增出了hppd基因，命名為Sthppd，經測序，Sthppd長為1071bp，GC含量為62％，編碼356個氨基酸。
[0015]與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
[0016]本專利技術自然界微生物庫中存在廣泛的各類基因資源，本研究從被除草劑污染的土壤中分離篩選到一株硝磺草酮高耐受菌株MST
?
5，從中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coli BL21(DE3)對StHPPD進行了異源表達和純化，研究了StHPPD對硝磺草酮的抗性，旨在為新型除草劑抗性基因的發掘和應用提供基礎材料。
[0017]通過臨床試驗表明，通過本方法可以較好的獲取自然界中已有以及轉基因植物中突變產生的各類有效的基因資源，并從中可以較快的篩選出適用于除草劑使用的基因序列以及克隆表達，從而為新型除草劑的研發奠定了基礎。
附圖說明
[0018]圖1為本專利技術菌株MST
?
5、MST
?
32和MST
?
66對硝磺草酮的降解能力的示意圖。
具體實施方式
[0019]下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。
[0020]實施例1
[0021]抗性HPPD基因的克隆表達的方法，包括以下步驟：
[0022]步驟一：對表層土壤和下水道污泥的進行采樣得到樣品，稱取2.0g樣品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培養基中，在30℃，180r/m富集培養5d，得到培養物；
[0023]步驟二：采用SDS
?
高鹽法提取抗性菌株基因組DNA，根據16S rRNA基因通用引物27F/1492R中進行序列比對，下載同源性高的模式菌株的16SrRNA基因序列，在MEGA6.0軟件中，利用鄰接法構建進化樹；
[0024]步驟三：根據同屬的Stenotrophomonas indicatrix WS40T的hppd基因序列，設計引物對Sthppd
?
F/Sthppd
?
R，以菌株MST
?
5基因組DNA為模板，PCR擴增Sthppd基因，并克隆到pMD18
?
T載體上，然后轉化至E.coli DH5a中，提取陽性克隆子的質粒并對Sthppd基因進行
測序，通過本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.抗性HPPD基因的克隆表達的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一：在土壤中進行采樣，采樣后進行破碎制樣，并稱取2.0g樣品；步驟二：配置培養基，培養基包括在50mL MSM溶液中加入2000μmol/L硝磺草酮；步驟三：將2.0g樣品加入在配置完成的培養基中，并放置在30℃的環境下，180r/m富集培養5d，得到培養物；步驟四：采用SDS
?
高鹽法提取抗性菌株基因組DNA，根據16S rRNA基因通用引物27F/1492R中進行序列比對；步驟五：檢索并下載同源性高的模式菌株的16S rRNA基因序列，在MEGA6.0軟件中，利用鄰接法構建進化樹；步驟六：根據同屬的Stenotrophomonas indicatrix WS40T的hppd基因序列，設計引物對Sthppd
?
F/Sthppd
?
R，以菌株MST
?
5基因組DNA為模板，PCR擴增Sthppd基因，并克隆到pMD18
?
T載體上，然后轉化至E.coli DH5a中，提取陽性克隆子的質粒并對Sthppd基因進行測序，通過NCBI數據庫中BLASTN和BLASTP對獲得的Sthppd基因序列進行核...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張磊，周立邦，牛冬冬，楊猷建，李林，
申請(專利權)人：南京厚土生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：