一種原位雜交探針及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種原位雜交探針及其制備方法與應(yīng)用。以目標(biāo)基因組為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，對所述原位雜交探針前體進(jìn)行超聲處理或PCR擴增，得到所述原位雜交探針，所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種原位雜交探針及其制備方法與應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測
，涉及一種原位雜交探針及其制備方法與應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]原位雜交技術(shù)(In
?
Situ Hybridization，簡稱ISH)是以帶有標(biāo)記物的DNA小片段，即雜交探針，與組織或細(xì)胞內(nèi)的DNA同源靶序列進(jìn)行雜交，通過檢測標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號，來檢測標(biāo)本中DNA(或基因)或染色體數(shù)目或位置變化的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。熒光原位雜交技術(shù)(Florescence In
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Situ Hybridization，簡稱FISH)是以熒光標(biāo)記的DNA探針與組織或細(xì)胞內(nèi)的DNA同源序列進(jìn)行雜交，通過在熒光顯微鏡下觀察和計數(shù)各種熒光信號的數(shù)量和分布來記錄和分析結(jié)果。
[0003]通常使用的探針包括克隆化酶標(biāo)探針和化學(xué)合成探針。克隆化酶標(biāo)探針使用較廣泛，以包含基因組片段的克隆(YAC、PAC、BAC等)為DNA模板，通過各種酶擴方法制備探針，優(yōu)點在于實現(xiàn)過程相對簡單，但缺點表現(xiàn)在因為基因組中含有重復(fù)區(qū)段和一些非靶序列，無法選擇標(biāo)記，且受限于克隆庫本身，只能對經(jīng)過確認(rèn)的克隆進(jìn)行標(biāo)記；化學(xué)合成探針是通過化學(xué)合成的方法制備的寡核苷酸探針，但受限于合成技術(shù)，當(dāng)合成長度大于59nt時，合成成本翻倍，且合成難度直線上升。
[0004]CN109439751A公開了一種用于KIAA1549
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BRAF融合基因檢測的探針制備方法，使用兩個標(biāo)記不同顏色的探針庫進(jìn)行檢測，去重復(fù)序列分析后，進(jìn)行序列分割1kb左右區(qū)塊，使用OligoArray進(jìn)行探針設(shè)計、篩選，要求長度50bp，TM值85
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99℃，探針最小間隔5bp，隨后在兩端分別加上通用接頭進(jìn)行合成，單條序列的合成長度約85bp，以合成的寡核苷酸庫為模板，使用帶有熒光標(biāo)記的通用引物進(jìn)行擴增，得到兩組熒光探針。該方法通過人工合成制備模板庫，然后使用帶標(biāo)記的通用引物，基于PCR方法擴增得到探針庫，可以實現(xiàn)對于間隔較小的融合檢測，但人工合成探針數(shù)量較高(約60條長片段合成)，且方法是借助于通用引物的熒光基團(tuán)實現(xiàn)熒光檢測，每100bp帶有兩個標(biāo)記，標(biāo)記效率略顯不足，且受限于PCR擴增的體積和設(shè)備制約，批量化生產(chǎn)時產(chǎn)能有限。
[0005]綜上所述，如何提供一種高效、低成本的原位雜交探針制備方法，制備高特異性探針，是分子生物學(xué)檢測
亟需解決問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本專利技術(shù)提供一種原位雜交探針及其制備方法與應(yīng)用，通過酶連成環(huán)和等溫擴增實現(xiàn)高效、低成本制備原位雜交探針，制備的原位雜交探針具備高特異性，且能夠進(jìn)行特殊易位類型檢測。
[0007]為達(dá)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
[0008]第一方面，本專利技術(shù)提供一種制備原位雜交探針的方法，所述方法包括：
[0009]以目標(biāo)基因組為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，
對所述原位雜交探針前體進(jìn)行超聲處理或PCR擴增，得到所述原位雜交探針，所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C
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seq、DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs，所述結(jié)合序列C
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seq從5
’
端至3
’
端依次包括5
’
靶結(jié)合區(qū)、通用引物結(jié)合區(qū)F、T7啟動子區(qū)、通用引物結(jié)合區(qū)R和3
’
靶結(jié)合區(qū)，所述5
’
靶結(jié)合區(qū)和3
’
靶結(jié)合區(qū)能夠與目標(biāo)基因組互補結(jié)合。
[0010]本專利技術(shù)中，分析目標(biāo)基因組序列，選擇非重復(fù)區(qū)設(shè)計并合成與靶區(qū)域互補的結(jié)合序列C
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seq，所述結(jié)合序列C
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seq在DNA連接酶作用下能形成環(huán)狀模板，結(jié)合示意圖如圖1所示，在聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，并進(jìn)一步通過超聲處理或PCR擴增獲得原位雜交探針，能夠有效避免重復(fù)片段的雜交探針，雜交后背景低，信號清晰，無需COT DNA封閉。
[0011]本專利技術(shù)中，滾環(huán)擴增是一個等溫擴增過程，擴增效率高，能夠富集含靶序列的片段，便于后續(xù)的探針制備，與傳統(tǒng)FISH探針制備的缺口平移技術(shù)相比，人工合成區(qū)段受限制較少，可方便的滿足各種基因檢測的需要。
[0012]本專利技術(shù)中，滾環(huán)擴增得到單鏈片段，可以無需變性，直接用于單鏈模板雜交，也可以通過預(yù)設(shè)的T7啟動子，實現(xiàn)RNA探針的制備。
[0013]優(yōu)選地，所述通用引物結(jié)合區(qū)F的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0014]優(yōu)選地，所述T7啟動子區(qū)的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0015]優(yōu)選地，所述通用引物結(jié)合區(qū)R的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
[0016]SEQ ID NO.1：ATGATACGGCGACCACCGAG。
[0017]SEQ ID NO.2：TAATACGACTCACTATAG。
[0018]SEQ ID NO.3：CAAGCAGAAGACGGCATACG。
[0019]優(yōu)選地，所述5
’
靶結(jié)合區(qū)和3
’
靶結(jié)合區(qū)與目標(biāo)基因組互補結(jié)合的區(qū)域位于目標(biāo)基因組非重復(fù)區(qū)。
[0020]優(yōu)選地，所述DNA連接酶包括T4 DNA連接酶。
[0021]優(yōu)選地，所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。
[0022]優(yōu)選地，所述制備原位雜交探針的方法包括以下步驟：
[0023](1)以目標(biāo)因組DNA為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C
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seq、DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修飾dUTP，所述修飾dUTP包括紅色
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dUTP、綠色
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dUTP或DIG
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dUTP；
[0024](2)超聲處理所述原位雜交探針前體，并電泳獲得所述原位雜交探針。
[0025]優(yōu)選地，步驟(1)所述滾環(huán)擴增產(chǎn)物長度大于15kb。
[0026]優(yōu)選地，步驟(2)所述電泳收集500bp以下單鏈核酸片段。
[0027]優(yōu)選地，步驟(1)所述dTTP和修飾dUTP的比例為(1～2):(2～3)，包括但不限于1:1、1:2或2:3。
[0028]本專利技術(shù)中，通過控制修飾dUTP和dTTP比例，能夠進(jìn)一步提高探針標(biāo)記效率更高。
[0029]優(yōu)選地，所述制備原位雜交探針的方法包括以下步驟：
[0030](1
’
)以目標(biāo)因組DNA為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C
?
seq、DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP；...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備原位雜交探針的方法，其特征在于，所述方法包括：以目標(biāo)基因組為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，對所述原位雜交探針前體進(jìn)行超聲處理或PCR擴增，得到所述原位雜交探針；所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C
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seq、DNA連接酶、DNA聚合酶和dNTPs；所述結(jié)合序列C
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seq從5
’
端至3
’
端依次包括5
’
靶結(jié)合區(qū)、通用引物結(jié)合區(qū)F、T7啟動子區(qū)、通用引物結(jié)合區(qū)R和3
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靶結(jié)合區(qū)，所述5
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靶結(jié)合區(qū)和3
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靶結(jié)合區(qū)能夠與目標(biāo)基因組互補結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備原位雜交探針的方法，其特征在于，所述通用引物結(jié)合區(qū)F的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；優(yōu)選地，所述T7啟動子區(qū)的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；優(yōu)選地，所述通用引物結(jié)合區(qū)R的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；優(yōu)選地，所述5
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靶結(jié)合區(qū)和3
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靶結(jié)合區(qū)與目標(biāo)基因組互補結(jié)合的區(qū)域位于目標(biāo)基因組非重復(fù)區(qū)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備原位雜交探針的方法，其特征在于，所述DNA連接酶包括T4 DNA連接酶；優(yōu)選地，所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1
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3任一項所述的制備原位雜交探針的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)以目標(biāo)因組DNA為模板使用滾環(huán)擴增試劑進(jìn)行滾環(huán)擴增，獲得原位雜交探針前體，所述滾環(huán)擴增試劑包括結(jié)合序列C
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...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何瑰，陳紹宇，
申請(專利權(quán))人：廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：