ENO1基因啟動子區甲基化位點及其在制備早期診斷和預后評估食管癌的試劑盒中的應用制造技術

本發明專利技術提供了ENO1基因啟動子區甲基化位點及其在制備早期診斷和預后評估食管癌的試劑盒中的應用，屬于疾病診斷及預后評級技術領域；ENO1基因啟動子區甲基化位點如SEQ ID No.1所示，提取食管鱗癌和癌旁正常樣本組織DNA，經亞硫酸氫鹽修飾后采用飛行質譜法檢測ENO1基因啟動子區CpG位點的甲基化頻率，同時采用免疫組化檢測食管鱗癌和癌旁正常組織樣本中ENO1蛋白的表達；研究發現食管鱗癌中ENO1基因啟動子區低甲基化且ENO1蛋白高表達，且其低甲基化的患者預后不良，ENO1可促進食管癌細胞的糖酵解水平，促進其增殖并抑制凋亡；檢測ENO1基因的甲基化水平用于食管鱗癌的早期診斷和預后評價的試劑。斷和預后評價的試劑。斷和預后評價的試劑。

【技術實現步驟摘要】
ENO1基因啟動子區甲基化位點及其在制備早期診斷和預后評估食管癌的試劑盒中的應用


[0001]本專利技術屬于疾病診斷及預后評級
，具體涉及ENO1基因啟動子區甲基化位點及其在制備早期診斷和預后評估食管癌的試劑盒中的應用。

技術介紹

[0002]食管癌（Esophageal carcinoma，EC）是全球致死相關癌癥中居第六位的腫瘤。食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌中最常見的組織學亞型，特別是在東亞，非洲東部和南部高發。在中國，約 90％的食管癌患者都為食管鱗狀細胞癌。中國的食管癌有明顯的地域分布，在河南、河北、江蘇、陜西、山西、福建等地居各腫瘤中的發病率居首位。盡管診斷和治療方法有所改善，但由于早期淋巴結轉移，食管鱗癌晚期患者的生存率仍然很低，其患者5年生存率仍較低。根據病因學和流行病學研究表明，食管癌的發生是多種因素共同發揮效應而導致的疾病。因此，當下尋找導致食管癌的致病因素和發病機制尤為重要。
[0003]烯醇化酶 1（ENO1）作為糖酵解中的關鍵酶，可以催化 2
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磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸。ENO1除行使糖酵解中的催化功能外，還在許多轉移性腫瘤中發揮重要作用。已有研究報道ENO1可以影響腫瘤細胞的增殖、細胞凋亡、侵襲和轉移等生物學行為。例如，在結腸癌中，ENO1可以通過調節AMPK/mTOR通路促進結腸癌的增殖、侵襲和遷移能力。此外，沉默ENO1 的表達可通過抑制 PI3K/ Akt途徑抑制神經膠質瘤細胞的生長，遷移和侵襲。在結直腸癌中，FBXW7通過蛋白酶體途徑來促進ENO1的泛素化水平降解，以降低腫瘤的糖酵解水平，最終抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。另有研究報道ENO1高表達的患者總體生存率降低。
[0004]食管癌的發生是由環境和遺傳因素共同作用引起的。DNA甲基化是人類基因組的主要表觀遺傳形式。在大多數類型的癌癥中，DNA甲基化通常存在異常。甲基化是基因組 DNA中胞嘧啶的共價修飾，主要發生在脊椎動物的CpG二核苷酸中，并且通常與長期轉錄抑制相關。通過檢索相關文獻，發現在食管癌中，P16、RASSF1A基因的啟動子區域均存在高甲基化狀態，高甲基化抑制基因的表達，從而促進癌癥的發展。申請人前期研究發現，食管鱗癌組織中miR
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203和miR
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34a甲基化水平明顯高于癌旁正常組織，且它們的高甲基化和表達水平具有顯著相關性，經分析還發現其高甲基化水平與淋巴結轉移顯著相關，表明其高甲基化水平促進食管鱗癌的發展。還發現，PLCE1基因啟動子區低甲基化調控其蛋白高表達，并通過NFκB通路和VEGF
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C/Bcl
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2的表達促進食管鱗癌細胞的血管生成和增殖。因此，探索食管癌中基因的甲基化對于ESCC的早期診斷，精確預后和個體化治療具有重要意義。

技術實現思路

[0005]為解決上述問題，本專利技術公開了一種ENO1基因啟動子區甲基化位點及其在制備早期診斷和預后評估食管癌的試劑盒中的應用。
[0006]為達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：
本專利技術的一個目的是提供ENO1基因啟動子區甲基化位點，ENO1基因啟動子區甲基化位點的甲基化區域如SEQ ID No.1所示。
[0007]進一步地，甲基化區域為ENO1基因轉錄起始點上游5094bp~5355bp處，包括22個CpG位點；甲基化區域轉錄為RNA片段，經RNase A酶切得到12個CpG單位，經RNase A酶切得到的12個CpG單位分別為CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16、CpG_20、CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19 和CpG_21.22。其中CpG_1、CpG_4、CpG_12、CpG_16 和 CpG_20未檢測到，成功檢測剩余的CpG單位：CpG_2.3、CpG_5.6.7.8、CpG_9.10.11、CpG_13、CpG_14.15、CpG_17.18.19和CpG_21.22。
[0008]進一步地，CpG_9.10.11的甲基化頻率作為診斷和診斷食管癌生存預后的生物標志物， CpG_9.10.11位點的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0009]本專利技術的另一個目的是提供一種用于擴增ENO1基因啟動子區甲基化位點的引物對，引物對為具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。
[0010]本專利技術的另一個目的是提供所述引物對在制備早期診斷和/或預后評估食管癌的試劑或試劑盒中的應用。
[0011]本專利技術的另一個目的是提供檢測ENO1基因啟動子區甲基化位點甲基化水平的試劑在制備早期診斷和/或預后評估食管癌的試劑或試劑盒中的應用；檢測ENO1基因啟動子區甲基化位點甲基化水平的試劑為DNA Methylation
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Gold
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。
[0012]本專利技術還有一個目的是提供一種檢測ENO1表達量的試劑在制備診斷和/或預后評價食管癌的試劑或試劑盒中的應用；檢測ENO1表達量的試劑為EZ
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96 DNA Methylation
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Gold
?
。
[0013]本專利技術的另一個目的是提供一種用于食管癌的早期診斷和預后評價的試劑盒，包括以上所述的引物對。
[0014]本專利技術的另一個目的是提供一種定量檢測所述的ENO1基因啟動子區甲基化位點甲基化水平的方法，包括以下步驟：1）提取食管鱗癌組織樣本的基因組DNA；2）用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA；3）以亞硫酸氫鹽處理后的DNA為模板，用上述的引物對進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；4）將PCR擴增產物依次進行蝦堿性磷酸酶處理、轉錄和酶切反應、樹脂純化和甲基化質譜分析，得到樣本的ENO1啟動子區全部CpG位點甲基化水平。
[0015]進一步地，PCR擴增反應的體系為：DNA模板2.0μL，濃度為10pmol/μL 的正向引物0.2μL，濃度為10 pmol/μL的反向引物0.2μL，濃度為5U/μL的PCR Enzyme 0.2μL，反應終濃度為200μM的dNTPs 1.0μL，反應終濃度為1
×
的 10
×
PCR Buffer 1.0μL，ddH2O補足體積至10μL。
[0016]進一步地，PCR擴增反應的程序為：94℃預變性4min；94℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45個循環；72℃延伸3min。
[0017]本專利技術的有益效果為：本專利技術提供的ENO1基因啟動子區甲基化位點，甲基化區域如SEQ ID No.1所示。檢測食管鱗癌組織中ENO1基因啟動子區特定CpG位點呈低甲基化狀態，而在癌旁正常組織細
胞中，ENO1基因啟動子區特定CpG位點呈相對高甲基本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種用于擴增ENO1基因啟動子區甲基化位點的引物對，其特征在于，所述引物對為具有如SEQ ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ ID No.3所示的下游引物。2.ENO1基因啟動子區甲基化位點在制備診斷和診斷食管癌生存預后的生物標志物的應用，其特征在于，所述ENO1基因啟動子區甲基化位點的甲基化區域如SEQ ID No.1所示，作為診斷和診斷食管癌生存預后的生物標志物的ENO1基因啟動子區甲基化位點為CpG_9.10.11位點，所述CpG_9.10.11位點的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。3.權利要求1所述引物對在制備早期診斷和/或預后評估食管癌的試劑或試劑...

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔曉賓，趙琳玥，王文潔，陳云昭，孫琦，丁友祥，禹潔，陳曦，李鋒，韓雪萍，孟凡青，
申請(專利權)人：南京鼓樓醫院，
類型：發明
國別省市：