檢測(cè)融合基因FNDC3B/RARA的融合型別的寡核苷酸及應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)為檢測(cè)融合基因FNDC3B/RARA的融合型別的寡核苷酸及應(yīng)用。先采用含有三種型別引物的多重引物熒光PCR進(jìn)行初檢。若出現(xiàn)陽性，再用特異性引物熒光PCR進(jìn)行具體型別鑒定，這樣既降低了初檢成本，又提高了檢測(cè)通量。本發(fā)明專利技術(shù)所述試劑盒特異性好，靈敏度高，通量大，適用于大批量樣本檢測(cè)。對(duì)于白血病診斷、調(diào)整治療方案、評(píng)價(jià)治療效果、預(yù)測(cè)預(yù)后、預(yù)防臨床復(fù)發(fā)都具有重要意義。有重要意義。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
檢測(cè)融合基因FNDC3B/RARA的融合型別的寡核苷酸及應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)屬生命科學(xué)和生物
，具體涉及一種篩查用途的白血病融合基因FNDC3B/RARA檢測(cè)的引物、探針和檢測(cè)試劑盒。

技術(shù)介紹

[0002]急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是(acute myeloid 1eukemia,AML)的一個(gè)特殊亞型M3型，約占AML的15％，發(fā)病年齡以20歲以上中青年為主，病程兇險(xiǎn)，有較高的出血傾向和早期死亡率。95％以上的APL患者可見其15號(hào)染色體和17號(hào)染色體易位，形成特征性的t(15；17)(q22；q21)，即PML
?
RARa融合基因，是APL特征性遺傳學(xué)標(biāo)志。但仍有約5％的患者缺乏該融合基因，稱為不典型APL患者。其中FNDC3B/RARA融合就是其中不典型融合中的一種。不典型APL患者中發(fā)現(xiàn)RARa與其它伙伴基因的融合，其伙伴基因不同，它們對(duì)ATRA和ATO治療的反應(yīng)性不一，如ATRA可靶向降解PML
?
RARa融合蛋白，恢復(fù)野生型RARa和PML基因功能，重新誘導(dǎo)粒細(xì)胞分化成熟。ATO可作用于PML，誘導(dǎo)PML
?
RARa融合蛋白和野生型PML蛋白快速降解。兩種藥物協(xié)同作用且無交叉耐藥，治療效果好，使APL成為臨床可治愈的急性髓細(xì)胞白血病。伴有PLZF
?
RARa和STAT5B
?
RARa融合基因的APL患者對(duì)ATRA治療不敏感或耐受，整體治療效果不佳，預(yù)后不良。伴有BCOR
?
RARa融合基因的APL患者對(duì)ATRA敏感但對(duì)ATO耐受。報(bào)導(dǎo)顯示有FNDC3B/RARA融合的APL對(duì)ATRA敏感。因此辨別不同的融合類型有利于個(gè)性化治療，可提高治療有效率，降低醫(yī)療費(fèi)用，提高患者生存率。
[0003]在急性白血病的臨床治療中，特別是針對(duì)APL的治療會(huì)進(jìn)行一個(gè)預(yù)后的評(píng)估分層，根據(jù)不同的預(yù)后分層選擇不同的治療方案。同時(shí)還需要對(duì)治療過程中融合基因的表達(dá)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以預(yù)測(cè)療效及復(fù)發(fā)的可能性。因此，RARa重排相關(guān)融合基因的篩查顯得尤為重要。
[0004]由于FNDC3B/RARA涉及的斷裂位點(diǎn)多樣，產(chǎn)生的融合基因種類也繁多，因此在臨床檢測(cè)上存在一定的困難。目前用于FNDC3B/RARA篩查的方法主要有：染色體核型分析，多重巢式PCR聯(lián)合電泳法。染色體核型分析通過肉眼觀察判斷，需對(duì)樣本中的有核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，具有核分裂相才能進(jìn)行觀察；而細(xì)胞培養(yǎng)增殖過程中，會(huì)出現(xiàn)某類細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長，“淹沒”病變細(xì)胞的可能，造成染色體核型正常的假象。其次，有些病例染色體的易位復(fù)雜且微小，無法靠肉眼觀察進(jìn)行分析。再者，染色體核型分析靈敏度無法滿足MRD(Minimal Residua Disease，微小殘留病灶)檢測(cè)的需求。而多重巢式PCR聯(lián)合電泳的方法耗時(shí)長，過程繁瑣，易污染，結(jié)果的判斷較主觀。且PCR反應(yīng)體系多，成本高，不適用于高通量的樣本檢測(cè)。只能進(jìn)行定性檢測(cè)的缺點(diǎn)，不能同時(shí)滿足靈敏度高和特異性好的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0005]鑒于目前篩查FNDC3B/RARA融合基因的方法學(xué)不能同時(shí)滿足經(jīng)濟(jì)高效、結(jié)果準(zhǔn)確且能用于MRD監(jiān)測(cè)等需求，故本專利技術(shù)設(shè)計(jì)出一套用于多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測(cè)常見融合基因的引物、探針，并構(gòu)思出一種靈敏度高，特異性好，檢測(cè)通量大，快速且準(zhǔn)確的篩查及型別鑒定
方案。
[0006]本專利技術(shù)設(shè)計(jì)了檢測(cè)內(nèi)參/目的基因用引物、探針，采用實(shí)時(shí)熒光RT
?
PCR，檢測(cè)內(nèi)參基因ABL、目的基因FNDC3B/RARA的融合型別。試劑盒通過調(diào)整內(nèi)參/目的基因的引物探針比例，以及RT
?
PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增效率和速率均達(dá)到最佳。
[0007]用于FNDC3B/RARA的檢測(cè)試劑盒中含有紅細(xì)胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液1、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液2、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液3、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液4、陽性對(duì)照品1、陽性對(duì)照品2、陽性對(duì)照品3、陽性對(duì)照品4、陰性對(duì)照品和內(nèi)參ABL反應(yīng)液。
[0008]檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液1包括THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS
?
101)、檢測(cè)目的基因用上下游引物分別為：RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R、RARA/FNDC3B 2
?
26
?
R、FNDC3B/RARA 24
?3?
F、FNDC3B/RARA 24
?3?
R和探針RARA/FNDC3B 2
?
Probe、FNDC3B/RARA 24
?3?
Probe，以用于初檢，所述引物和探針序列如下：
[0009]RARA/FNDC3B 2
?
F:CAGCACCAGCTTCCAGTTAGTG
[0010]RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R:CCTTCTAACTGTGTTACTCGAGG
[0011]RARA/FNDC3B 2
?
26
?
R:TGTGGCTTCTTCTCCCTTGTACA
[0012]FNDC3B/RARA 24
?3?
F:AACCTATACCTTCAGCACAACC
[0013]FNDC3B/RARA 24
?3?
R:GTGGTAGCCTGAGGACTTGT
[0014]RARA/FNDC3B 2
?
Probe:HEX
?
ATATAGCACACCATCCC
?
TAMRA
[0015]FNDC3B/RARA 24
?3?
Probe:FAM
?
AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA
–
TAMRA
[0016]檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液2包括THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS
?
101)，用于鑒別RARA/FNDC3B 2
?
25的引物RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R以及探針RARA/FNDC3B 2
?
Probe。探針、引物序列如下，
[0017]RARA/FNDC3B 2
?
F:CAGCACCAGCTTCCAGTTAGTG
[0018]RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R:CCTTCTAACTGTGTTACTCGAG本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.檢測(cè)融合基因FNDC3B/RARA的融合型別的寡核苷酸，其特征在于，包括引物RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R、RARA/FNDC3B 2
?
26
?
R、FNDC3B/RARA 24
?3?
F、FNDC3B/RARA 24
?3?
R和探針RARA/FNDC3B2
?
Probe、FNDC3B/RARA 24
?3?
Probe，所述引物和探針序列如下：RARA/FNDC3B 2
?
F:CAGCACCAGCTTCCAGTTAGTGRARA/FNDC3B 2
?
25
?
R:CCTTCTAACTGTGTTACTCGAGGRARA/FNDC3B 2
?
26
?
R:TGTGGCTTCTTCTCCCTTGTACAFNDC3B/RARA 24
?3?
F:AACCTATACCTTCAGCACAACCFNDC3B/RARA 24
?3?
R:GTGGTAGCCTGAGGACTTGTRARA/FNDC3B 2
?
Probe:HEX
?
ATATAGCACACCATCCC
?
TAMRAFNDC3B/RARA 24
?3?
Probe:FAM
?
AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA
–
TAMRA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，用于鑒別RARA/FNDC3B 2
?
25的引物RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R以及探針RARA/FNDC3B2
?
Probe；用于鑒別RARA/FNDC3B 2
?
26的引物RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
26
?
R以及探針RARA/FNDC3B 2
?
Probe；用于鑒別FNDC3B/RARA 24
?
3的引物FNDC3B/RARA 24
?3?
F、FNDC3B/RARA 24
?3?
R以及探針FNDC3B/RARA 24
?3?
Probe。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，還包括用于內(nèi)參基因ABL檢測(cè)的引物ABL
?
F、ABL
?
R以及探針ABL
?
Probe，所述引物和探針序列為：ABL
?
F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAABL
?
R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAABL
?
Probe:CY5
?
GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT
?
BHQ。4.檢測(cè)融合基因FNDC3B/RARA的融合型別的寡核苷酸的試劑盒，其特征在于，包括引物RARA/FNDC3B 2
?
F、RARA/FNDC3B 2
?
25
?
R、RARA/FNDC3B 2
?
26
?
R、FNDC3B/RARA 24
?3?
F、FNDC3B/RARA 24
?3?
R和探針RARA/FNDC3B2
?
Probe、FNDC3B/RARA 24
?3?
Probe，所述引物和探針序列如下：RARA/FNDC3B 2
?
F:CAGCACCAGCTTCCAGTTAGTGRARA/FNDC3B 2
?
25
?
R:CCTTCTAACTGTGTTACTCGAGGRARA/FNDC3B 2
?
26
?
R:TGTGGCTTCTTCTCCCTTGTACAFNDC3B/RARA 24
?3?
F:AACCTATACCTTCAGCACAACCFNDC3B/RARA 24
?3?
R:GTGGTAGCCTGAGGACTTGTRARA/FNDC3B 2
?
Probe:HEX
?
ATAT...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王淑一，張敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：合肥艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：