一種從樣本中提取微生物DNA的方法，主要流程包括樣本的液化以及病原微生物核酸抽提，液化包括液化試劑和Benzonase核酸酶的添加，Benzonase核酸酶的同時添加不僅可以雙重液化樣本還可以去除部分宿主核酸并減少宏基因組提取時間，有利于后續從臨床樣本中分離病原微生物DNA，該方法能更高效更充分降低樣本粘度，去除樣品中破損宿主細胞的核酸污染，大幅度節約時間成本，有利于宏基因組的快速檢測。有利于宏基因組的快速檢測。
【技術實現步驟摘要】
一種從樣本中提取微生物DNA的方法
[0001]本專利技術涉及微生物分子檢測領域，具體地，涉及一種從樣本中提取微生物DNA的方法，主要的樣本包括痰液和膿腫液。
技術介紹
[0002]呼吸道疾病引起的感染主要涉及痰液樣本，其常見的感染性病原微生物有鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、煙曲霉、黑曲霉單純皰疹病毒等，這些病原微生物多具有傳染性需要在生物安全柜中嚴格操作，一般的實驗室不具備操作設備。常見的痰液樣本較為粘稠，需要做液化處理才能破壞痰液樣本中的粘聯蛋白，目前多應用的液化試劑為氫氧化鈉、二硫蘇糖醇、N
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乙酸
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L半胱氨酸，在2009張軍力等人比較了四種痰液處理方法發現saccomanno法和DTT法聯合應用對痰液的固定和液化較好，但上述處理方法時間較長，且不能去除宿主核酸，延長病原微生物處理時間和增大實驗數據分析難度。呼吸道微生物方面卻因為呼吸道樣品粘度大、定植菌較多，人源核酸含量高，判斷致病微生物較困難而進展緩慢。
[0003]對于膿腫而言發生的部位較多，可以位于體表或腹腔內，常見的引起膿腫的致病菌為金黃色葡萄球菌，但不同部位發生的膿腫致病菌大不相同，有時用藥無效后需要借助其他手段查明引發感染的致病菌。傳統的病原檢測方法包括涂片鏡檢，免疫學檢測，微生物培養，分子檢測。然而這些方法每次只能檢測到一種或有限的病原體，此外培養還存在陽性率低的缺點，且臨床樣本中收集的膿腫液大多比較粘稠，樣本整體呈現渾濁色，經高速離心后沉淀分離不明顯，棄上清液時不易去除干凈，獲得的沉淀物提取的核酸產物純度并不高且大部分是宿主核酸。新興的宏基因組檢測技術(mNGS)能對特定環境下的微生物群體基因組進行測序，規避傳統方法中絕大部分微生物不能培養的缺陷，但對于人源DNA比例高的問題為致病的病原微生物檢測帶來難度。
技術實現思路
[0004]為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種從樣本中高效提取病原微生物DNA的方法，不僅充分液化樣本，還同時添加了去人源核酸試劑，降低時間成本，增大病原微生物的提取空間，為病原微生物宏基因組提取提供有利條件。
[0005]為了實現上述目的，本專利技術是通過以下方案予以實現的：一種從樣本中提取微生物DNA的方法，包括以下步驟：
[0006](1)向樣本盒中加入液化試劑和去宿主的試劑，進行樣本的雙重液化疊加去宿主流程；
[0007]所述液化試劑包括甲醇溶液和二硫蘇糖醇溶液，甲醇溶液與二硫蘇糖醇溶液的體積比為8
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12:1；二硫蘇糖醇溶液采用二硫蘇糖醇溶解于甲醇溶液配制而成，其中二硫蘇糖醇的濃度為0.08
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0.12g/mL，所述甲醇溶液質量分數為10％
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30％；
[0008]所述去宿主的試劑中的核酸酶為核酸酶；核酸酶裂解
液成分為Tris
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Hcl和Mgcl；
[0009](2)37℃孵育半小時后加入終止反應試劑淬滅反應，所述終止反應試劑包括EDTA和NaCl；EDTA終濃度為3
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5mM，pH為7.0
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8.0；NaCl終濃度為140
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150mM；
[0010](3)充分震蕩后離心棄上清，加入PBS洗滌，再離心棄上清，加入PBS，得到處理后樣品；
[0011](4)將微生物細胞破碎后，進行微生物核酸的提取；微生物細胞采用煮沸法、研磨法或化學裂解法進行破碎，破碎后采用過柱法抽提DNA。
[0012]所述煮沸法采用物理加熱法破碎微生物細胞；所述研磨法屬于機械法破碎病原微生物細胞，采用氧化鋯珠為研磨珠；所述化學裂解法屬于化學法破碎病原微生物細胞，采用的化學試劑為蛋白酶K和裂解液。所述樣本為痰液樣本或膿腫液樣本。
①
樣本的雙重液化疊加去宿主流程；
②
病原微生物核酸抽提；用于樣本的高效液化還具有部分宿主核酸去除功效，用于去除部分宿主核酸后的病原微生物核酸提取。樣本的液化流程包括液化試劑和核酸酶：液化試劑包括：甲醇、二硫蘇糖醇；液化試劑甲醇濃度為10％
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30％；液化試劑二硫蘇糖醇的配制是稱取一定量的二硫蘇糖醇，添加10％
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30％的甲醇試劑，搖勻后放入冰箱備用；
[0013]去宿主流程所用的試劑為核酸酶；核酸酶為核酸酶(5KU)；去宿主流程為了使核酸酶發揮一定的作用需要自行配制使用核酸酶裂解液；酸酶裂解液主要成分為Tris
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Hcl和Mgcl；
[0014]去宿主流程所用終止反應試劑為EDTA和NaCl；終止試劑EDTA終濃度為3
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5mM，pH 7.0
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8.0；NaCl終濃度為140
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150mM；
[0015]病原微生物核酸抽提流程具有煮沸流程，屬于物理法破碎病原微生物細胞；
[0016]病原微生物核酸抽提流程中的煮沸流程，其煮沸溫度在90℃
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95℃；病原微生物核酸抽提流程具有研磨流程，屬于物理加熱法破碎病原微生物細胞；
[0017]病原微生物核酸抽提流程中的研磨流程，所用的研磨珠為氧化鋯珠；病原微生物核酸抽提流程具有化學裂解流程，屬于化學法破碎病原微生物細胞；
[0018]病原微生物核酸抽提流程為過柱法抽提DNA。
[0019]本專利技術的有益效果為：向樣本添加液化試劑(包括甲醇DTT、核酸酶)后痰液明顯變得勻質化，此時的核酸酶發揮著雙重功效，一方面促進痰液的勻質化，一方面消解不完整細胞(宿主細胞無細胞壁結構，更容易破碎)暴露出的核酸，在測量樣本濃度時就有體現，核酸酶的加入會在一定程度降低樣本提取濃度，另一方面樣本人源DNA的比例會有所降低，在一定程度上提高了病原微生物的占比。
[0020]該方法能更高效更充分降低樣本粘度，對于痰液樣本勻漿的更充分，對于膿腫液樣本上清分離的更明顯，同時兩者均去除樣品中破損宿主細胞的核酸污染，大幅度節約時間成本，有利于臨床樣本病原微生物宏基因組的快速檢測。
具體實施方式
[0021]實施例1
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痰液樣本
[0022]為了更好的說明液化試劑和Benzonase核酸酶的同時添加既可以降低樣本粘度使其更勻漿，還可以降低樣本人源DNA比例，特設置了對比例1，即對比例1中無Benzonase核酸
酶添加。
[0023]實施例1中：在超凈工作臺中，向痰液樣本盒中直接加入5倍體積的30％濃度的甲醇溶液和已配制好的DTT溶液，加入比例為10:1(如1000ul甲醇+100ulDTT)；封好膜后震蕩樣本至無肉眼可見粘稠狀物質，分裝入1.5ml的離心管內；在1.5ml樣本中加入1ul Benzonase酶和10x Benzonase buffer至其終濃度為1x。Benzonase buffer包括Tris
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Hcl和Mgcl。
[0024]37℃孵育半小時本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種從樣本中提取微生物DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)向樣本盒中加入液化試劑和去宿主的試劑，進行樣本的雙重液化疊加去宿主流程；所述液化試劑包括甲醇溶液和二硫蘇糖醇溶液，甲醇溶液與二硫蘇糖醇溶液的體積比為8
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12:1；二硫蘇糖醇溶液采用二硫蘇糖醇溶解于甲醇溶液配制而成，其中二硫蘇糖醇的濃度為0.08
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0.12g/mL，所述甲醇溶液質量分數為10％
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30％；所述去宿主的試劑中的核酸酶為核酸酶；核酸酶裂解液成分為Tris
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Hcl和Mgcl；(2)37℃孵育半小時后加入終止反應試劑淬滅反應，所述終止反應試劑包括EDTA和NaCl；EDTA終濃度為3
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【專利技術屬性】
技術研發人員：徐君南，趙毅，范星菊，于丹，
申請(專利權)人：遼寧康惠生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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