HPV抗原表位及其鑒定方法、應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種HPV抗原表位及其鑒定方法、應(yīng)用，該HPV抗原表位包括1）HPV E7蛋白的75

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
HPV抗原表位及其鑒定方法、應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及生物
，具體地，本專利技術(shù)涉及HPV抗原表位及其鑒定方法、應(yīng)用，更具體地，本專利技術(shù)涉及一種鑒定HPV抗原表位的方法、分離的肽、突變體、表達載體、抗原呈遞細胞、免疫效應(yīng)細胞、試劑在制備試劑盒中的用途、試劑盒、所述分離的肽或表達載體或抗原呈遞細胞或免疫細胞在制備藥物中的用途、藥物、疫苗和診斷系統(tǒng)。

技術(shù)介紹

[0002]人乳頭瘤病毒（HPV）感染是幾乎所有浸潤性宮頸癌和部分肛門生殖器惡性腫瘤和口腔癌的致病原因。以宮頸癌為例，人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是導(dǎo)致子宮頸癌的主要致病因素，當(dāng)前已發(fā)展為世界上第四大常見女性癌癥，疾病負(fù)擔(dān)十分嚴(yán)重。
[0003]隨著精準(zhǔn)醫(yī)療號角的吹起，各種免疫治療的腫瘤靶向藥踴躍出現(xiàn)。其中腫瘤疫苗因其高度特異性，療效強，不良反應(yīng)發(fā)生率低等特性，獲得了極高的研發(fā)關(guān)注。已有的HPV腫瘤免疫療法以預(yù)防性HPV疫苗為主，已上市的預(yù)防性疫苗主要為HPV2價、4價及9價疫苗，可以針對特定的幾種HPV高危分型及低危分型病毒進行免疫保護。但預(yù)防性疫苗以預(yù)防為主，并不能清除已存在的感染，對已感染的HPV患者來說并不能起到治愈的效果，HPV 治療性疫苗的研發(fā)及臨床應(yīng)用變得刻不容緩。
[0004]HPV 治療性疫苗通過產(chǎn)生針對HPV病毒顆粒的中和抗體來刺激細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而針對特異性靶標(biāo)殺死受 HPV感染的細胞。HPV病毒屬人乳頭瘤空泡病毒 A 屬的雙鏈球形 DNA 病毒，結(jié)構(gòu)簡單、無包膜。其基因組編碼了6種早期調(diào)控蛋白 ( E1、E2、E4、E5、E6、E7) 和兩種晚期結(jié)構(gòu)蛋白( L1 和 L2)。早期基因編碼蛋白負(fù)責(zé)病毒 DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、癌變及轉(zhuǎn)化。設(shè)計HPV治療性疫苗通常針對的靶抗原基因為病毒早期蛋白E6和E7。E6和E7蛋白一直以來被認(rèn)為是HPV相關(guān)研究中最關(guān)鍵的致癌蛋白。HPV病毒感染發(fā)生后，由病毒增殖衍生的E6、E7表達蛋白可以通過影響p53抑癌基因和PRB視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白來促進腫瘤后期的快速發(fā)生及發(fā)展。同時，兩種蛋白序列在廣泛的HPV亞型中均得到了良好的保護，可以作為HPV治療性疫苗探索性研究中極具吸引力和應(yīng)用性的靶標(biāo)。
[0005]通常治療性疫苗會將來源于靶標(biāo)具有潛在治療效力的靶抗原以多種形式傳遞給抗原呈遞細胞(Antigen
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Presenting Cell, APC)，從而遞送至主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex， MHC) 分子上，激活抗原特異性的CD8 +毒性T細胞或CD4 +輔助 T細胞產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，以達到治療作用。主要組織相容性復(fù)合物是一種存在于脊椎動物的龐大基因家族編碼的細胞表面分子，其與機體免疫反應(yīng)關(guān)系十分密切。在人類中，其又被稱為人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）。HLA具有高度多態(tài)性，化學(xué)本質(zhì)是一類糖蛋白，在所有有核細胞中均有表達。Ⅰ類HLA抗原的特異性取決于HLA分子的α重鏈，由HLA
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A、B、C位點編碼，并由此衍生出HLA
?
A、B、C的不同基因分型。HLAⅠ類復(fù)合物的主要功能是將HLAⅠ類來源于宿主或外來物如病毒表達蛋白等的基因產(chǎn)物，通過胞內(nèi)內(nèi)源機制加工后翻譯剪切形成關(guān)鍵的治療性抗原肽，近而通過形成的MHC復(fù)合物將抗原肽呈遞給CD8+細胞毒性T細胞啟動和調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答。抗原多肽序列相關(guān)的抗原決定
簇，即被稱之為HLAⅠ類限制性抗原表位。因HLA基因的高度多態(tài)性，HLA
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A、B、C基因來源的不同對應(yīng)了 HLA
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A、B、C不同分型限制性抗原表位，在HPV相關(guān)的病毒感染病患研究中，HLA
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A0201基因分型占比最高。同時，已知的HPV病毒分型，約有200種以上。綜合生物學(xué)特性及致癌潛能，通常被分為高危性和低危性。低危型 HPV 如 6、11、42、43、44 等，常引起外生殖器疣等良性病變，高危型 HPV分型如 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等與宮頸癌及上皮內(nèi)病變關(guān)系密切，其中高危致病分型又以HPV16型在各類病患中占比最高，治療性更為迫切。因此，鑒定HPV16型病毒的HLA
?Ⅰ
類限制性多肽表位對于治療性疫苗的制備具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0006]本專利技術(shù)是基于專利技術(shù)人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：HPV治療疫苗是免疫治療領(lǐng)域的研究熱點，其中，獲得有效的HPV病毒表位是極其關(guān)鍵的，專利技術(shù)人通過對HLA
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I類MHC
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抗原肽復(fù)合物進行免疫親和捕獲，固相萃取復(fù)合物中的抗原肽，并采用超高效液相色譜
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質(zhì)譜技術(shù)對獲得的抗原肽進行分析，從而鑒定出HPV病毒表位。
[0007]由此，在本專利技術(shù)的第一方面，本專利技術(shù)提出了一種鑒定HPV抗原表位的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，包括以下步驟：1）將HLA
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I類抗體與載體以1mL：5mg
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1mL：2mg的體積質(zhì)量比進行結(jié)合，以獲得免疫親和柱；2）將HPV陽性細胞進行裂解處理；將步驟2）所獲得的細胞裂解液進行過柱處理，所述柱為所述免疫親和柱，以獲得包含HPV抗原肽的HLA復(fù)合物；3）將所述包含HPV抗原肽的HLA復(fù)合物進行固相萃取，以獲得肽段。專利技術(shù)人對鑒定HPV抗原表位的方法進行了篩選和優(yōu)化，當(dāng)所述HLA
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I類抗體與載體以1mL：5mg
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1mL：2mg的體積質(zhì)量比進行結(jié)合時，抗體的結(jié)合率較高，將獲得的包含HPV抗原肽的HLA復(fù)合物進行固相萃取時鑒定通量較高，本專利技術(shù)實施例的方法顯著提高了獲得與所述HLA
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I類分子有效結(jié)合的HPV抗原肽的概率，顯著縮短了鑒定時間。
[0008]在本專利技術(shù)的第二方面，本專利技術(shù)提出了一種分離的肽。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，包括下列中的至少之一：1）HPV E6蛋白的65
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72位氨基酸；2）HPV E7蛋白的4
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11位氨基酸；3）HPV E7蛋白的75
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82位氨基酸；4）HPV E7蛋白的75
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83位氨基酸；5）HPV E7蛋白的77
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86位氨基酸；6）HPV E7蛋白的77
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90位氨基酸；以及7）HPV E7蛋白的79
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88位氨基酸。根據(jù)本專利技術(shù)實施例的分離的肽是由HPV E6或E7早期編碼區(qū)表達翻譯獲得的，所述分離的肽可以由HLA
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I類分子呈遞，被CTL細胞或TIL細胞識別，進而可被表達HLA
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I類分子的呈遞細胞遞呈給CTL或TIL細胞而激活特異性T細胞免疫，構(gòu)成了HPV陽性腫瘤的免疫應(yīng)答的生理靶標(biāo)，進行高靈敏度及特異性檢測，對于HPV相關(guān)疾病的預(yù)防和治療來說具有重要價值。
[0009]在本專利技術(shù)的第三方面，本專利技術(shù)提出了一種HPV 抗原表位。根據(jù)本發(fā)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種分離的肽，其特征在于，包括下列中的至少之一：1）HPV E7蛋白的75
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83位氨基酸；2）HPV E7蛋白的75
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82位氨基酸；3）HPV E7蛋白的77
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86位氨基酸；4）HPV E7蛋白的77
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90位氨基酸；5）HPV E7蛋白的79
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88位氨基酸；以及6）HPV E7蛋白的4
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11位氨基酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的肽，其特征在于，所述HPV E7蛋白為HPV16 E7蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的肽，其特征在于，所述分離的肽包含與HLA
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A、HLA
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B或HLA
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C分子結(jié)合的氨基酸片段。4.根據(jù)權(quán)利要求1
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3任一項所述的分離的肽，其特征在于，包括SEQ ID NO:2
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7所示氨基酸序列中的至少之一。5.一種突變體，其特征在于，相較于權(quán)利要求1
?
4任一項所述的分離的肽，所述突變體在除錨定位外具有至少一個突變位點。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的突變體，其特征在于，相較于權(quán)利要求1
?
4任一項所述的分離的肽，當(dāng)所述分離的肽是8肽時，所述突變體具有如下突變中的至少之一：第1位、第3位、第5位、第6位、第7位；當(dāng)所述分離的肽不是8肽時，所述突變體具有如下突變中的至少之一：第1位、第3位、第5位、第6位、第8位。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的突變體，其特征在于，相較于權(quán)利要求1所述的1）HPV E7蛋白的75
?
83位氨基酸，所述突變體具有如下突變中的至少之一：1）第1位的D突變?yōu)镕或Y；2）第3位的R突變?yōu)長或P；3）第5位的L突變?yōu)閅或缺失；4）第6位的E突變?yōu)閅；5）第8位的L突變?yōu)門。8.根據(jù)權(quán)利要求5
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7任一項所述的突變體，其特征在于，所述突變體具有SEQ ID NO：13~17任一所示的氨基酸序列。9.一種表達載體，其特征在于，攜帶表達權(quán)利要求1
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4任一項所述的分離的肽或權(quán)利要求5
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8任一項所述的突變體的核酸。10.一種抗原呈遞細胞，其特征在于，所述細胞可呈遞權(quán)利要求1
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4任一項所述的分離的肽或權(quán)利要求5
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8任一項所述的突變體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗原呈遞細胞，其特征在于，所述抗原呈遞細胞是通過下列至少之一獲得的：將具有抗原呈遞能力的細胞與所述分離的肽或HPV抗原表位進行接觸；將權(quán)利要求9所述的表達載體導(dǎo)入所述具有抗原呈遞能力的細胞。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗原呈遞細胞，其特征在于，所述具有抗原呈遞能力的細胞為樹突狀細胞、B細胞或單核
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吞噬細胞。13.一種免疫效應(yīng)細胞，其特征在于，所述免疫效應(yīng)細胞可識別權(quán)利要求1
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4任一項所述的多肽、權(quán)利要求5
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8任一項所述的突變體或識別在細胞表面呈遞權(quán)利要求1
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4任一項所
述的多肽或權(quán)利要求5
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8任一項所述的突變體的抗原呈遞細胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫效應(yīng)細胞，其特征在于，所述免疫效應(yīng)細胞是通過下列方式獲得的：將權(quán)利要求10
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12任一項所述的抗原呈遞細胞與具有免疫效應(yīng)能力的細胞接觸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫效應(yīng)細胞，其特征在于，所述具有免疫效應(yīng)能力的細胞為T細胞。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫效應(yīng)細胞，其特征在于，所述具有免疫效應(yīng)能力的細胞為CD8
+
T細胞。17.試劑在制備試劑盒中的用途...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李波，周璀，張攀，
申請(專利權(quán))人：武漢華大吉諾因生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：