一種血漿保存液、采血管以及其在ctDNA檢測中的用途制造技術

本發明專利技術涉及一種血漿保存液、采血管以及其在ctDNA檢測中的用途，屬于液體活檢技術領域。包括：抗凝劑50

【技術實現步驟摘要】
一種血漿保存液、采血管以及其在ctDNA檢測中的用途


[0001]本專利技術涉及一種血漿保存液、采血管以及其在ctDNA檢測中的用途，屬于液體活檢


技術介紹

[0002]液態活檢作為一種新興的檢測技術在腫瘤臨床中的應用日趨成熟，已成為突變基因檢測、動態監測、癌癥早期篩查的重要手段。其中，基于血液的液態活檢是最主要的研究方向，主要是對血液中的循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環腫瘤細胞和外泌體進行基因檢測。ctDNA(circulating tumor DNA，循環腫瘤DNA)是指人體血液循環系統中不斷流動的攜帶一定特征(包括突變、重排、拷貝數異常、甲基化等)來自腫瘤基因組的DNA片段。ctDNA的主要來源包括：來自壞死的腫瘤細胞；來自凋亡的腫瘤細胞；循環腫瘤細胞；來自腫瘤細胞分泌的外排體。目前，CTDNA的檢測主要基于兩種特征信息：突變和甲基化。突變檢測在靶向藥的敏感性和抗耐藥性方面具有一定的優勢。而甲基化檢測在早期診斷、預后監測以及后續的療效判斷方面具有一定的優勢。
[0003]在臨床中，由于實驗條件等限制，無法在獲得血液后的短時間內分離出血漿，通常容易導致血液中紅細胞和白細胞破裂、cfDNA降解等問題，影響后續檢測。因此，需使用添加特定保護成分的采血管進行血液樣本采集，以有效減少細胞破裂和血漿cfDNA降解，使血液能夠穩定保存和運輸，避免對后續實驗結果產生干擾。血液cfDNA保存成分通常包括抗凝劑、防腐劑、核酸酶抑制劑、代謝抑制劑、甲醛淬滅劑和細胞膜保護劑等。
[0004]另外，在現有的采血管中的保存液成分中，通常含有自由基成分，使得血液樣品保存后會導致cfDNA的降解，進而使得存儲后的樣品無法較好地滿足測序要求；為了解決該問題，通常會在保存液中加入一定量的自由基捕獲劑，用于對保存液以及采血管中殘留的自由基進行捕獲固定，然而在采血管作為未使用的耗材在存儲期間，所使用的自由基捕獲劑會緩慢地與其它材料/原料中殘留的自由基進行反應，導致其存儲時間縮短，影響了其效期。

技術實現思路

[0005]本專利技術所要解決的技術問題是：在進行用于ctDNA檢測用的血漿樣本的保存時，常規的存儲試劑易導致cfDNA的降解，使得樣本不能較好地滿足ctDNA測序要求。
[0006]一種血漿保存液，包括：
[0007]抗凝劑50
?
200mg/ml、防腐劑50
?
300mg/ml、醛淬滅劑10
?
100mg/ml、細胞膜保護劑10
?
80mg/ml、代謝抑制劑2
?
35mg/ml、自由基捕獲劑5
?
50mg/ml、水。
[0008]所述的抗凝劑是EDTA鉀鹽。
[0009]所述的防腐劑選自重氮烷基脲。
[0010]所述的醛淬滅劑是甘氨酸。
[0011]所述的細胞膜保護劑是海藻糖或山梨醇中的一種或兩種的混合。
[0012]所述的代謝抑制劑是金精三羧酸或者二硫蘇糖醇中的一種或兩種的混合。
[0013]所述的自由基捕獲劑選自酚類或者有機酸類中的一種或兩種的混合。
[0014]所述的酚類是4
?
甲氧基苯酚、2,6
?
二叔丁基
?4?
甲基苯酚、2
?
叔丁基氫醌、兒茶酚、2,6
?
二甲基苯醌、對硝基酚。
[0015]所述的有機酸類選自苯丙氨酸、水楊酸或者對苯二甲酸。
[0016]所述的代謝抑制劑是負載于熱脹型溫敏水凝膠中。
[0017]所述的代謝抑制劑的制備方法包括如下步驟：
[0018]按重量份計，將N
?
異丙基丙烯酰胺10
?
15份、丙烯酰胺20
?
30份、N
?
羥甲基丙烯酰胺5
?
10份、交聯劑0.5
?
1份、引發劑0.1
?
0.3份，加水300
?
350份進行共聚反應，產物洗滌后干燥，得到干凝膠；
[0019]將干凝膠在含有自由基捕獲劑的乙醇水溶液中浸泡，再減壓干燥后，得到負載捕獲劑的溫敏凝膠。
[0020]交聯劑是N,N
?
亞甲基雙丙烯酰胺，所述的引發劑是過硫酸鉀或者亞硫酸氫鈉中的一種或兩種的混合。
[0021]共聚反應是在15
?
25℃下反應10
?
60min，浸泡過程是室溫下浸泡10
?
100h。
[0022]所述的干凝膠與乙醇水溶液的質量比1：3
?
5；自由基捕獲劑在乙醇水溶液中的質量比5
?
10％；乙醇水溶液中乙醇占體積比30
?
50％。
[0023]一種采血管，其中裝載有上述的血漿保存液。
[0024]上述的血漿保存液在用于制備ctDNA檢測用樣品中的用途。
[0025]有益效果
[0026]本專利技術中提供的血漿保存液能夠有效地對采血樣本進行保存，特別適用于ctDNA檢測的樣本處理過程，其具有存儲時間長、避免ctDNA降解的優點；
[0027]通過添加二硫蘇糖醇作為代謝抑制劑，減少ctDNA降低，使其能夠穩定保存；
[0028]通過采用山梨醇作為細胞膜保護劑，有效地保證了血樣細胞完整性，并減小了存儲樣本溶血情況的發生；
[0029]通過使用自由基捕獲劑，有效避免了原料等引入的羥自由基對cfDNA的降解；
[0030]通過在灌裝過程中將自由基捕獲劑用熱脹型溫敏水凝膠負載，在低溫條件下有效地將捕獲劑封閉，避免貨架存儲期間與羥自由基的反應，待存儲樣本時進行釋放，有效提高了貨架期。
附圖說明
[0031]圖1是實施例1
?
9的采血管對血漿樣品采血后的溶血率比較；
[0032]圖2是實施例5、7、9的采血管在貨架存儲后進行采血后的cfDNA質量分析儀檢測結果對比；
[0033]圖3是實施例5、7、9的采血管在貨架存儲后進行采血后的DNA提取量比較；
具體實施方式
[0034]實施例1
[0035]按照以下原料濃度，準備各組分原料，并配制成溶液：
[0036]EDTA
?
K3 100mg/ml、重氮烷基脲200mg/ml、甘氨酸40mg/ml、海藻糖20mg/ml、金精三羧酸0.5mg/ml、二硫蘇糖醇15mg/ml。
[0037]實施例2
[0038]與實施例1的區別在于：二硫蘇糖醇的濃度改為5mg/ml。
[0039]按照以下原料濃度，準備各組分原料，并配制成溶液：
[0040]EDTA
?
K3 100mg/ml、重氮烷基脲200mg/ml、甘氨酸40mg/ml、海藻糖20mg/ml、金精三羧酸0.5mg/ml、二硫蘇糖醇5mg/ml。...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種血漿保存液，其特征在于，包括：抗凝劑50
?
200mg/ml、防腐劑50
?
300mg/ml、醛淬滅劑10
?
100mg/ml、細胞膜保護劑10
?
80mg/ml、代謝抑制劑2
?
35mg/ml、自由基捕獲劑5
?
50mg/ml、水。2.根據權利要求1所述的血漿保存液，其特征在于，所述的抗凝劑是EDTA鉀鹽；所述的防腐劑選自重氮烷基脲；所述的醛淬滅劑是甘氨酸。3.根據權利要求1所述的血漿保存液，其特征在于，所述的細胞膜保護劑是海藻糖或山梨醇中的一種或兩種的混合；所述的代謝抑制劑是金精三羧酸或者二硫蘇糖醇中的一種或兩種的混合。4.根據權利要求1所述的血漿保存液，其特征在于，所述的自由基捕獲劑選自酚類或者有機酸類中的一種或兩種的混合。5.根據權利要求1所述的血漿保存液，其特征在于，所述的酚類是4
?
甲氧基苯酚、2,6
?
二叔丁基
?4?
甲基苯酚、2
?
叔丁基氫醌、兒茶酚、2,6
?
二甲基苯醌、對硝基酚；所述的有機酸類選自苯丙氨酸、水楊酸或者對苯二甲酸。6.根據權利要求1所述的血漿保存液，其特征在于，所述的代謝抑制劑是負載于熱脹型溫敏水凝膠中。7.根據權利要求1所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙瑾，盛巧蕓，蔣亞輝，韓良培，張麗，
申請(專利權)人：南京兔牙醫療器械有限公司，
類型：發明
國別省市：