檢測SMAD4基因全外顯子突變的引物、方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于檢測SMAD4基因全外顯子突變的引物、方法及試劑盒，所述特異性引物包括擴增覆蓋SMAD4基因全部12個外顯子的正反向引物；本發(fā)明專利技術(shù)采用Sanger測序法檢測SMAD4基因全外顯子突變，可快速檢測SMAD4基因全外顯子的突變。利用本發(fā)明專利技術(shù)完成的檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可以專一性鑒別SMAD4基因是否突變，確保了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和唯一性；可輔助疾病診斷，提高疾病的風(fēng)險評估，對早期干預(yù)、早期治療有重要的參考意義。要的參考意義。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
檢測SMAD4基因全外顯子突變的引物、方法及試劑盒


[0001]本專利技術(shù)屬基因檢測
，具體涉及檢測SMAD4基因全外顯子突變的引物、方法以及試劑盒。

技術(shù)介紹

[0002]SMAD4基因是一種新型抑癌基因，最初由Hahn等在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)，亦被稱為胰腺癌缺失基因4(Deleted in Pancreatic Cancer
?
4,DPC4)，位于人類染色體18q21.1，該基因序列包含12個外顯子，轉(zhuǎn)錄子長2680bp，編碼的蛋白SMAD4由552個氨基酸殘基組成。SMAD4編碼的蛋白屬于SMAD家族，可以被跨膜絲氨酸：蘇氨酸受體激酶激活，是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。大多數(shù)研究認(rèn)為，SMAD4在TGF
?
β信號傳導(dǎo)途徑中作為關(guān)鍵性中間傳導(dǎo)分子，所有生物學(xué)效應(yīng)均是受體調(diào)節(jié)蛋白SMAD4與其他SMAD蛋白(包括R—SMAD、Atagonistic SMAD)相互作用的結(jié)果，在參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程以及組織的生長發(fā)育、再生、修復(fù)中起到重要作用。
[0003]正是因為SMAD4在信號傳導(dǎo)通路中的中心作用，故SMAD4基因的突變、丟失和表達(dá)下調(diào)均會導(dǎo)致信號傳導(dǎo)通路異常，最終導(dǎo)致一些腫瘤的發(fā)生。SMAD4的常見的變異類型主要有：1.染色體片段的缺失；2.基因突變；3.基因表達(dá)水平異常。研究表明SMAD4基因在多種癌癥中存在缺失或低表達(dá)，與常見癌癥例如大腸癌、胰腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一個不容忽視的基因突變。有研究表明SMAD4基因在大腸癌早期很少發(fā)生突變但是SMAD4表達(dá)與組織分化程度、腫瘤大小浸、潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。大腸癌是結(jié)直腸正常黏膜上皮在各種致癌因素作用下發(fā)生的惡性腫瘤，是消化道較為常見的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的特點，預(yù)后不良是消化道癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率極高，現(xiàn)今治療手段以手術(shù)切除為主且發(fā)病機制仍尚未明確。另外，大約50％的胰腺癌患者伴有SMAD4基因的缺失或變異，與胰腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移預(yù)后關(guān)系極其密切。胰腺癌發(fā)生早期并無明顯癥狀，確診時多屬晚期，故關(guān)于SMAD4抑癌基因的研究對胰腺癌診斷、治療具有潛在的應(yīng)用價值。
[0004]雖然SMAD4在諸多水平、復(fù)雜而協(xié)調(diào)的具體調(diào)控機制及其調(diào)控失衡與腫瘤之間的關(guān)系還未見報道，但近幾年關(guān)于SMAD4基因突變在消化道疾病轉(zhuǎn)移和預(yù)后的評估及預(yù)測越來越多，通過對患者SMAD4基因的檢測可以輔助診斷疾病，對一些癌癥進(jìn)行預(yù)防，降低癌癥的發(fā)生風(fēng)險，也能更合理有效的選擇治療方案，因此對SMAD4基因進(jìn)行全外顯子測序具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0005]本專利技術(shù)的第一個目的是提供SMAD4基因全外顯子序列測序相關(guān)引物的核酸序列，包括覆蓋SMAD4基因全部12個外顯子突變位點的正、反向引物，以及一對測序引物M13F和M13R，其堿基序列為：
[0006]SMAD4
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1F：CAGGTGTGTCGTAGGATTCG
[0007]SMAD4
?
1R：GGGAGAAGGTGGCTAGGTTG
[0008]SMAD4
?
2F：TTTCCTTGCAACGTTAGCTG
[0009]SMAD4
?
2R：GGAGCACAAATTAAATTACCCTG
[0010]SMAD4
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3F：CTGAGTTGGTAGGATTGTGAGG
[0011]SMAD4
?
3R：TGAAACACTATTGAGATCCTTTTCC
[0012]SMAD4
?
4F：GCGTTTATGCTACTTCTGAATTG
[0013]SMAD4
?
4R：TTAATGTTACTGCCTGCCGC
[0014]SMAD4
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5F：CCGCTGAATAAATGACTTTTGC
[0015]SMAD4
?
5R：TTCCAAGTGATTGTGCATACC
[0016]SMAD4
?6?
7F：CCCATCTTTATAGTTGTGCATTATC
[0017]SMAD4
?6?
7R：AAAACAGAAAACAAAGCCCTACC
[0018]SMAD4
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8F：TTGGCAGATAGCACTGAAATG
[0019]SMAD4
?
8R：CCCCATAATTCCATTAAAGCC
[0020]SMAD4
?
9F：TGTGGAGTGCAAGTGAAAGC
[0021]SMAD4
?
9R：TGTACATGGGAAAACATAACCTTG
[0022]SMAD4
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10F：GAATTCATACTACATGCTCCTGACAC
[0023]SMAD4
?
10R：TTTTCCATTCCTTCCACCC
[0024]SMAD4
?
11F：TCCAAGCCACCTTTCCTAAC
[0025]SMAD4
?
11R：ACAGAAGAACAGATTTTACCAATTC
[0026]SMAD4
?
12F：AGGATGGGAAGAGATCACCC
[0027]SMAD4
?
12R：CAGGATTGTATTTTGTAGTCCACC
[0028]M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
[0029]M13R：AACAGCTATGACCATG
[0030]在檢測中先利用上述SMAD4基因全外顯子的正、反向引物對樣本基因組DNA進(jìn)行擴增，獲得擴增產(chǎn)物再利用上述測序引物分別對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得擴增產(chǎn)物的基因序列。
[0031]所述核酸序列在制造評估腸癌風(fēng)險的試劑盒中的應(yīng)用。
[0032]本專利技術(shù)的第二個目的在于提供一種檢測SMAD4基因全外顯子序列突變的方法，其包括以下步驟：
[0033](1)提取樣本中的基因組DNA；
[0034](2)利用至少一對擴增引物對(1)中的DNA進(jìn)行擴增，獲得擴增產(chǎn)物；
[0035](3)利用一對測序引物M13F和M13R對(2)中的擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的基因序列；
[0036](4)將(3)中的堿基序列與SMAD4基因野生型參考序列進(jìn)行比較，確定突變位點是否存在。
[0037]進(jìn)一步地，SMAD4
?
1F：SMAD4
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1R、SMAD4
?
2F：SMAD4
?
2R、SMAD4
?
3F：SMAD4
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3R、SMAD4
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4F：SMAD4
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4R、SMAD4
?本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一組檢測SMAD4基因全外顯子序列突變位點的特異性引物，其特征在于，包括擴增覆蓋SMAD4基因全部12個外顯子的正、反向引物，其堿基序列為：SMAD4
?
1F：CAGGTGTGTCGTAGGATTCGSMAD4
?
1R：GGGAGAAGGTGGCTAGGTTGSMAD4
?
2F：TTTCCTTGCAACGTTAGCTGSMAD4
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2R：GGAGCACAAATTAAATTACCCTGSMAD4
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3F：CTGAGTTGGTAGGATTGTGAGGSMAD4
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3R：TGAAACACTATTGAGATCCTTTTCCSMAD4
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4F：GCGTTTATGCTACTTCTGAATTGSMAD4
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4R：TTAATGTTACTGCCTGCCGCSMAD4
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5F：CCGCTGAATAAATGACTTTTGCSMAD4
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5R：TTCCAAGTGATTGTGCATACCSMAD4
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7F：CCCATCTTTATAGTTGTGCATTATCSMAD4
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7R：AAAACAGAAAACAAAGCCCTACCSMAD4
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8F：TTGGCAGATAGCACTGAAATGSMAD4
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8R：CCCCATAATTCCATTAAAGCCSMAD4
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9F：TGTGGAGTGCAAGTGAAAGCSMAD4
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9R：TGTACATGGGAAAACATAACCTTGSMAD4
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10F：GAATTCATACTACATGCTCCTGACACSMAD4
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10R：TTTTCCATTCCTTCCACCCSMAD4
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11F：TCCAAGCCACCTTTCCTAACSMAD4
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11R：ACAGAAGAACAGATTTTACCAATTCSMAD4
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12F：AGGATGGGAAGAGATCACCCSMAD4
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12R：CAGGATTGTATTTTGTAGTCCACC。2.如權(quán)利要求1所述的特異性引物，其特征在于，還包括一對測序引物，其堿基序列為：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。3.如權(quán)利要求1所述的特異性引物，其特征在于，SMAD4
?
1F：SMAD4
?
1R、SMAD4
?
2F：SMAD4
?
2R、SMAD4
?
3F：SMAD4
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3R、SMAD4
?
4F：SMAD4
?
4R、SMAD4
?
5F：SMAD4
?
5R、SMAD4
?6?
7F：SMAD4
?6?
7R、SMAD4
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8F：SMAD4
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8R、SMAD4
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9F：SMAD4
?
9R、SMAD4
?
10F：SMAD4
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10R、SMAD4
?
11F：SMAD4
?
11R或SMAD4
?
12F：SMAD4
?
12R的比值均為1：1。4.如權(quán)利要求2所述的特異性引物，其特征在于，M13F：M13R的比值為1：1。5.一種檢測SMAD4基因全外顯子序列突變位點的方法，其包括以下步驟：(1)提取樣本中的基因組DNA；(2)利用SMAD4基因每個外顯子對應(yīng)的正、反向擴增引物對前述(1)中的DNA進(jìn)行擴增，獲得覆蓋SMAD4全外顯子序列突變位點的擴增產(chǎn)物；(3)利用一對測序引物M13F和M13R對(2)中的擴增產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的基因序列；(4)將(3)中的基因序列與SMAD4基因野生型參考序列(NG_013...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡嘉慧，王淑一，
申請(專利權(quán))人：合肥艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：