一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，包括以下步驟：S1：提供4

【技術實現步驟摘要】
一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法


[0001]本申請涉及酶檢測
，尤其涉及一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法。

技術介紹

[0002]堿性磷酸酶(ALP)是一種哺乳動物組織中的重要水解酶，具有催化磷酸酯的水解和磷酸化功能。作為醫療診斷的關鍵生物標記物，ALP主要存在于肝臟、腎臟、腸道、骨骼和血清中，健康成人血清中ALP濃度大小范圍為46～190mU/mL，若表達水平異常，會造成心力衰竭、腎功能惡化、肝功能障礙、膽汁淤積、血管鈣化、骨病和乳腺癌等疾病。為了保護人類健康，對ALP進行早期診斷與檢測是迫在眉睫的事情。迄今為止，對ALP的檢測方法主要包括：比色法、表面增強拉曼散射法、電化學分析法和色譜分析法等。在這些檢測方法中，熒光檢測技術因其固有的優勢，如高靈敏度、實時檢測和原位成像的特點而被廣泛關注。目前，有機熒光分子、半導體量子點、金納米簇、銅納米簇等多種熒光材料被用于ALP的檢測中。但是有機熒光探針水溶性較差，半導體量子點毒性較大，熒光共聚物制備步驟復雜且費時，貴金屬納米簇成本較高且穩定性差。因此，開發能夠簡便、靈敏檢測ALP活性的方法是當前研究的重點。
[0003]水凝膠是高分子聚合物經化學鍵合或物理纏繞交聯而成的，以水為分散介質的具有三維網絡結構的高分子材料。瓊脂糖是重要的水溶性聚合物之一，具有良好的親水性，并幾乎完全不存在帶電基團，對敏感的生物大分子極少引起變性和吸附，是理想的惰性載體。瓊脂糖水凝膠不僅具有良好的生物相容性，還具有可降解性和無毒性。基于熒光探針制備的水凝膠傳感器，可以利用原位生成碳點的熒光信號，用于酶活性的可視化檢測。

技術實現思路

[0004]針對現有技術中的缺陷，本專利技術提出了一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，包括以下步驟：
[0005]S1：提供4
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氨基苯磷酸鈉鹽、瓊脂糖及緩沖液，將所述4
?
氨基苯磷酸鈉鹽與所述瓊脂糖添加至所述緩沖液中，獲得第一混合液；
[0006]S2：加熱攪拌使所述第一混合液中的所述瓊脂糖充分融化后，將液體倒入模具，冷卻形成第一固態交聯物；
[0007]S3：在所述第一固態交聯物表面添加待測堿性磷酸酶，加熱生成第二固態交聯物；
[0008]S4：在所述第二固態交聯物表面添加(3
?
氨基丙基)三甲氧基硅烷液體，繼續加熱生成第三固態交聯物
[0009]S5：將所述第三固態交聯物置于紫外分析儀下，在365nm激發光下觀察所述第三固態交聯物的熒光顏色。
[0010]在其中一個實施例中，所述第一混合液中4
?
氨基苯磷酸鈉鹽溶液的濃度為1
?
100mM，所述瓊脂糖占所述第一混合液中的質量的0.5％
?
5％。
[0011]在其中一個實施例中，所述步驟S2的加熱溫度為100
?
160℃，加熱時間為5
?
10min。
[0012]在其中一個實施例中，所述步驟S3的加熱溫度為40
?
90℃，加熱時間為15
?
120min。
[0013]在其中一個實施例中，所述步驟S4的加熱溫度為30
?
90℃，加熱時間為10
?
100min。
[0014]在其中一個實施例中，所述(3
?
氨基丙基)三甲氧基硅烷液體與所述第一固態交聯物的體積比為1:2
?
1:1。
[0015]在其中一個實施例中，所述緩沖液為二乙醇胺緩沖液、伯瑞坦
?
羅賓森緩沖液、檸檬酸
?
檸檬酸鈉緩沖液中的任意一種，且所述緩沖液的pH值為8.0
?
10.2。
[0016]在其中一個實施例中，在步驟S1完成后，進行步驟S2之前，還包括步驟S2a：向所述第一混合液中加入參比物。
[0017]在其中一個實施例中，所述參比物為羅丹明、熒光碳量子點、熒光硅量子點、熒光CdTe量子點中的至少一種，所述參比物在紫外光照下呈現紅色。
[0018]在其中一個實施例中，所述參比物在反應體系中的濃度為0.01
?
0.1mg/mL。
[0019]這種可視化檢測方法步驟非常簡單，僅通過低溫加熱冷卻即可得到形狀尺寸可控的水凝膠傳感器。通過將待測物滴加到水凝膠傳感器表面加熱并結合紫外燈下觀察到水凝膠傳感器明顯的顏色變化，即可實現堿性磷酸酶的可視化半定量檢測，具有廣闊的應用前景。
附圖說明
[0020]下面結合附圖對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細的說明：
[0021]圖1示出了本專利技術實施例水凝膠傳感器制備及檢測的步驟流程圖；
[0022]圖2示出了本專利技術實施例水凝膠傳感器的檢測效果圖。
具體實施方式
[0023]為了更詳細地闡明本專利技術，下面結合優選實施例和附圖對本專利技術的技術方案做進一步闡述。
[0024]結合圖1
?
2，在本申請中，提出了一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，包括以下步驟：
[0025]S1：提供4
?
氨基苯磷酸鈉鹽、瓊脂糖及緩沖液，將所述4
?
氨基苯磷酸鈉鹽與所述瓊脂糖添加至所述緩沖液中，獲得第一混合液；
[0026]S2：加熱攪拌使所述第一混合液中的所述瓊脂糖充分融化后，將液體倒入模具，冷卻形成第一固態交聯物；
[0027]S3：在所述第一固態交聯物表面添加待測堿性磷酸酶，加熱生成第二固態交聯物；
[0028]S4：在所述第二固態交聯物表面添加(3
?
氨基丙基)三甲氧基硅烷液體，繼續加熱生成第三固態交聯物；
[0029]S5：將所述第三固態交聯物置于紫外分析儀下，在365nm激發光下觀察所述第三固態交聯物的熒光顏色。
[0030]本專利技術運用的原理是4
?
氨基苯磷酸鈉鹽經堿性磷酸酶催化作用后，去除磷酸基團且進一步與(3
?
氨基丙基)三甲氧基硅烷液體發生席夫堿反應，從而生成淡藍色熒光碳點，不同用量的堿性磷酸酶得到的碳點的熒光信號不同，即可以通過收集熒光信號得到相應的
堿性磷酸酶的用量。
[0031]在一些優選的實施方案中，還可在檢測過程中加入參比物，進行比率熒光探針的搭建，提高不同濃度堿性磷酸鹽在紫外光照下的熒光色差，進一步提升對堿性磷酸酶的可視化檢測效果。優選地，參比物可以是羅丹明、熒光碳量子點、熒光硅量子點、熒光CdTe量子點中的至少一種，這些參比物在紫外光照下呈現紅色，與反應系統中的藍色熒光碳量子點形成明顯的顏色對比，對于不同濃度的堿性磷酸酶檢測可以獲得更明顯的顏色漸變信息，可明顯提升檢測的可視化效果。
[0032]其中步驟S1和步驟S2通過底物的加入和凝膠的制備，進行了水凝膠傳感平臺的搭建。通過大量實驗探究最佳反應條件時可得知，優選地，所述瓊脂糖占所述第一混合液本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：S1：提供4
?
氨基苯磷酸鈉鹽、瓊脂糖及緩沖液，將所述4
?
氨基苯磷酸鈉鹽與所述瓊脂糖添加至所述緩沖液中，獲得第一混合液；S2：加熱攪拌使所述第一混合液中的所述瓊脂糖充分融化后，將液體倒入模具，冷卻形成第一固態交聯物；S3：在所述第一固態交聯物表面添加待測堿性磷酸酶，加熱生成第二固態交聯物；S4：在所述第二固態交聯物表面添加(3
?
氨基丙基)三甲氧基硅烷液體，繼續加熱生成第三固態交聯物；S5：將所述第三固態交聯物置于紫外分析儀下，在365nm激發光下觀察所述第三固態交聯物的熒光顏色。2.根據權利要求1所述的用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，其特征在于，所述第一混合液中4
?
氨基苯磷酸鈉鹽溶液的濃度為1
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100mM，所述瓊脂糖占所述第一混合液中的質量的0.5％
?
5％。3.根據權利要求1所述的用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，其特征在于，所述步驟S2的加熱溫度為100
?
160℃，加熱時間為5
?
10min。4.根據權利要求1所述的用于堿性磷酸酶檢測的可視化檢測方法，其特征在于，所述步驟S3的加熱溫度為40
?
90℃，加熱時間為15
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【專利技術屬性】
技術研發人員：劉玉菲，韓亞琴，張佳婧，張國秀，楊達，
申請(專利權)人：重慶大學，
類型：發明
國別省市：