長效GDF15融合蛋白及包含其的藥物組合物制造技術

本發明專利技術涉及包含具有增加的生理活性和體內穩定性的GDF15變體的融合蛋白，以及包含其的藥物組合物。根據本發明專利技術的GDF15變體或長效GDF15融合蛋白在體內效力、對GDF15受體的結合親和力和體重減輕作用方面優于常規GDF15變體。因此，包含作為活性成分的本發明專利技術的GDF15變體、長效GDF15融合蛋白或融合蛋白二聚體的藥物組合物引起食欲抑制，由此可以有效地用作用于代謝疾病或肥胖的治療劑。此外，包含作為活性成分的GDF15變體、長效GDF15融合蛋白或融合蛋白二聚體的藥物組合物可以用于與用于代謝疾病的化學藥物和其他治療劑的組合治療等，并且可以有效地用于與用于代謝疾病或肥胖的常規治療劑的組合治療。規治療劑的組合治療。規治療劑的組合治療。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】長效GDF15融合蛋白及包含其的藥物組合物


[0001]本專利技術涉及包含具有增加的生理活性和體內穩定性的GDF15變體的融合蛋白，以及包含其的藥物組合物。

技術介紹

[0002]生長分化因子
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15(growth differentiation factor
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15，GDF15)也稱為巨噬細胞抑制性細胞因子
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1(macrophage inhibitory cytokine
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1，MIC
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1)、胎盤骨形態發生蛋白(placental bone morphogenetic protein，PBMP)或非甾體抗炎藥物活化基因
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1(nonsteroidal anti
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inflammatory drug
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activated gene
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1，NAG
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1)，是作為轉化生長因子
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β(transforming growth factor
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beta，TGF
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β)超家族成員的蛋白質。
[0003]最近，研究結果表明，GDF15通過與腦組織中特異性表達的GDNF家族受體α樣(GDNF family receptor alpha
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like，GFRAL)和ret原癌基因(ret proto
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oncogene，RET)結合來抑制飲食攝入，從而導致體重減輕(Tsai VW,et al.,PLoS One 2013；8(2):e55174；US 8,192,735)。此外，多項研究表明，在向多種肥胖動物模型施用GDF15的情況下，GDF15具有優異的體重減輕作用，并已確定除了具有這種作用外，GDF15還具有例如降低血糖水平、改善血脂水平和改善胰島素抵抗的代謝優勢。
[0004]然而，野生型GDF15的問題在于，在將其用于醫學的情況下，由于其體內半衰期短，因此需要高頻率的施用。因此，正在努力開發旨在增加GDF15體內半衰期的長效制劑。
[0005]同時，在生產長效制劑的多種技術中，免疫球蛋白Fc融合技術使用最廣泛，因為它導致體內半衰期增加，并且幾乎不擔心副作用例如毒性或誘導免疫應答。為了將免疫球蛋白Fc融合的GDF15蛋白開發成長效的治療性藥物，必須滿足以下幾個條件。
[0006]第一，應使由融合引起的體外活性降低最小化。已知GDF15融合蛋白的活性變化很大地取決于融合位點。因此，已將突變引入至GDF15的Fc融合GDF15蛋白的活性變化可取決于是否發生融合或融合位點。第二，融合應導致體內半衰期增加，并且體內半衰期增加應體現能夠在人中以每周一次的間隔施用的藥物代謝動力學譜。第三，考慮到大多數生物制藥可引起患者中的免疫原性，應使由融合接頭或突變引起的免疫原性的風險最小化。第四，不應存在由于融合位點或突變引入的穩定性問題。第五，由于取決于融合免疫球蛋白的同種型可發生不期望的免疫應答，因此需要替代實施方案。
[0007]當努力改善GDF15的生理活性和穩定性時，本專利技術人已經確定，在GDF15的特定位置引入突變并且免疫球蛋白Fc區與其結合的情況下，GDF15具有增強的活性和增加的體內半衰期，從而完成了本專利技術。
[0008]專利技術的公開內容
[0009]技術問題
[0010]本專利技術的一個目的是提供具有改善的生理活性和穩定性的GDF15變體以及長效GDF15融合蛋白。
[0011]本專利技術的另一個目的是提供用于預防或治療糖尿病、肥胖、血脂異常或代謝綜合
征的藥物組合物，其包含作為活性成分的GDF15變體或長效GDF15融合蛋白。
[0012]問題的解決方案
[0013]為了實現上述目的，在本專利技術的一個方面中，提供了式(I)所示的GDF15變體。
[0014]N端延伸結構域
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核心結構域(I)
[0015]在本專利技術的另一個方面中，提供了長效GDF15融合蛋白，其中GDF15變體與人IgG Fc或其變體結合。
[0016]在本專利技術的又一個方面中，提供了融合蛋白二聚體，其包含兩種長效GDF15融合蛋白。
[0017]在本專利技術的又一個方面中，提供了分離的核酸分子，其編碼GDF15變體或GDF15融合蛋白。
[0018]在本專利技術的又一個方面中，提供了表達載體，其包含所述核酸分子。
[0019]在本專利技術的又一個方面中，提供了宿主細胞，其包含所述表達載體。
[0020]在本專利技術的又一個方面中，提供了用于預防或治療糖尿病、肥胖、血脂異常或代謝綜合征的藥物組合物，其包含作為活性成分的GDF15變體、長效GDF15融合蛋白或融合蛋白二聚體。
[0021]專利技術的有益作用
[0022]根據本專利技術的GDF15變體或長效GDF15融合蛋白在體外效力、對GDF15受體的結合親和力和體重減輕作用方面優于常規GDF15變體。
[0023]因此，包含作為活性成分的GDF15變體、長效GDF15融合蛋白或融合蛋白二聚體的本專利技術的藥物組合物引起食欲抑制，因此可有效地用作用于代謝疾病或肥胖的治療劑。
[0024]此外，包含作為活性成分的GDF15變體、長效GDF15融合蛋白或融合蛋白二聚體的藥物組合物可以用于與用于代謝疾病的化學藥物和其他治療劑的組合治療等，并且可以有效地用于與用于代謝疾病或肥胖的常規治療劑的組合治療。
[0025]附圖簡述
[0026]圖1示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM4、FM4
?
1、FM4
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2和FM4
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3)獲得的結果，其中成熟GDF15中第56位氨基酸天冬酰胺(N)和/或成熟GDF15中第103位氨基酸天冬氨酸(D)被另外的氨基酸替換。
[0027]圖2示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM9、FM13、FM14、FM15和FM16)獲得的結果，其中成熟GDF15中第64位氨基酸絲氨酸(S)被另外的氨基酸替換。
[0028]圖3示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM4、FM5和FM9)獲得的結果。
[0029]圖4示出了通過在對GDF15受體(GFRAL和RET)的結合親和力方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM4、FM5和FM9)獲得的結果。
[0030]圖5示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM1和FM10)獲得的結果。
[0031]圖6示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM2和FM11)獲得的結果。
[0032]圖7示出了通過在活性方面比較長效GDF15融合蛋白(二聚體：FM3和FM12)獲得的結果。
[0033]圖8示出了通過在對GDF15受體(GFRAL和RET)的結合親和本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.式(I)所示的GDF15變體：N端延伸結構域
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核心結構域(I)(在式(I)中，所述N端延伸結構域是由SEQ ID NO:3至5的任一氨基酸序列組成的多肽；以及所述核心結構域是SEQ ID NO:20所示的多肽，或者是衍生自SEQ ID NO:20的多肽且其中選自在SEQ ID NO:20的氨基酸序列中的第15、50、58、97位的氨基酸及其組合的任一氨基酸被另外的氨基酸替換；其中第15位氨基酸精氨酸(R)被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或纈氨酸(V)替換，第50位氨基酸天冬酰胺(N)被丙氨酸、精氨酸(R)、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸替換，第58位氨基酸絲氨酸(S)被丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸替換，以及第97位氨基酸天冬氨酸(D)被丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸替換)。2.權利要求1所述的GDF15變體，其中所述核心結構域包含選自以下改變(1)至(6)中的任一改變：(1)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第15位氨基酸精氨酸(R)被天冬酰胺(N)替換的改變；(2)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第50位氨基酸天冬酰胺(N)被亮氨酸(L)替換的改變；(3)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第58位氨基酸絲氨酸(S)被賴氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、半胱氨酸(C)或亮氨酸(L)替換的改變；(4)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第97位氨基酸天冬氨酸(D)被亮氨酸(L)替換的改變；(5)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第50位氨基酸天冬酰胺(N)和SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第97位氨基酸天冬氨酸(D)各自被半胱氨酸(C)或絲氨酸(S)替換的改變；以及(6)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第15位氨基酸精氨酸(R)被天冬酰胺(N)替換并且SEQ ID NO:20的氨基酸序列中第58位氨基酸絲氨酸(S)被賴氨酸(K)或精氨酸(R)替換的改變。3.權利要求2所述的GDF15變體，其中所述核心結構域由選自SEQ ID NO:6至19的任一氨基酸序列組成。4.權利要求1所述的GDF15變體，其中所述GDF15變體包含由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成的N端延伸結構域和由SEQ ID NO:8、9或20所示的氨基酸序列組成的核心結構域。
5.權利要求1所述的GDF15變體，其中所述GDF15變體包含由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列組成的N端延伸結構域和由SEQ ID NO:8、9或20所示的氨基酸序列組成的核心結構域。6.權利要求1所述的GDF15變體，其中所述GDF15變體包含由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列組成的N端延伸結構域和由選自SEQ ID NO:6至19的任一氨基酸序列組成的核心結構域。7.權利要求1所述的GDF15變體，其中所述GDF15變體由選自SEQ ID NO:21至39的任一氨基酸序列組成。8.長效GDF15融合蛋白，其中權利要求1至7中任一項所述的GDF15變體與人IgG Fc或其變體結合。9.權利要求8所述的長效GDF15融合蛋白，其中所述IgG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林世榮，樸永奉，金秀勁，沈博拉，朱美敬，梁智銀，崔鉉浩，鄭元暉，金元泰，李允雨，金埈煥，
申請(專利權)人：株式會社柳韓洋行，
類型：發明
國別省市：