利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法技術

本發明專利技術提供了一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，包括如下步驟：(1)等量選取自受精起發育至24

【技術實現步驟摘要】
利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法


[0001]本專利技術屬于化妝品毒性評價
，具體涉及一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法。

技術介紹

[0002]適用于嬰幼兒的化妝品一直都是被認為安全可靠的，但是具體的安全性有待測定。在相關的日化產品標準和法規中都有針對嬰童日化產品的要求，如：《化妝品安全技術規范》(2015版)、《GB/T 29679
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2013洗發液》、《GB 8372
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2008牙膏》、《QB/T 1859
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2013爽身粉》、《QB/T 1994
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2013沐浴液》等，都對嬰兒產品做出了比成人產品更高的要求。嬰童日化產品市場越來越廣闊，購買人數及使用人數逐年遞增，也正是如此，對于這一類產品的安全性評價十分重要，而嬰童類化妝品基礎原料的發育毒性檢測更是其中不可或缺的一種方法。
[0003]我國的化妝品基礎原材料包含苯氧乙醇類等，當這些化妝品原材料含量超標，則對嬰童的生長發育存在一定的影響，因此需限量使用，而對于含量指標濃度設定的技術手段多種多樣。
[0004]目前在發育毒性測試中使用最多的是大小鼠致畸試驗，而隨著3R原則的推廣和動物替代實驗的不斷深入研究，胚胎毒性的胚胎干細胞試驗(Embryonic stem cell test，EST)如大鼠全胚胎培養、胚胎細胞微團培養、小鼠胚胎干細胞培養等，作為替代方法獲得了美國國家環境保護及經濟合作與發展組織(OECD)的認可。除此之外，爪蟾胚胎致畸實驗(FETAX)也是一種有效地用于檢測受試物發育毒性的方法，將受試物對熱帶爪蟾胚胎進行48h暴露后觀察統計胚胎情況和存活率。但這些方法評價指標評判的主觀性較強，依賴于實施者的經驗，實驗結果不確定性大；同時動物實驗對動物傷害大，不符合3R原則，并存在實驗周期長，實驗復雜等問題。因此急需一種能夠簡單有效評測化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法。

技術實現思路

[0005]本專利技術為解決上述技術問題開展，提供了一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，實現化妝品原料對個體發育毒性的直觀評價。本專利技術中選用斑馬魚模型，操作簡單，易于觀察，且斑馬魚的基因與人類相似，故可以作為一種快捷、有效的評價手段。
[0006]本專利技術的技術方案如下：提供一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，包括如下步驟：
[0007](1)確定待測基礎原料的安全濃度：等量選取自受精起發育至24
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72h的斑馬魚胚胎暴露于多組含有不同梯度濃度基礎原料的胚胎培養液中，培養72h，統計每組胚胎的孵化率和畸形率，選取孵化率＞95％且不會引起斑馬魚機體器官損傷、發育畸形的基礎原料濃度作為安全濃度；
[0008](2)評價發育毒性：將自受精起發育至24
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72h的斑馬魚胚胎平均分為對照組及多組處理組，其中對照組的斑馬魚胚胎不予給藥正常培養，處理組的斑馬魚暴露于具有安全濃度基礎原料的胚胎培養液培養，培養72h后，對其進行心率、發育畸形程度、ROS氧化應激以及生長發育相關基因表達情況的測定評價，根據測定結果評價所述基礎原料的發育毒性。
[0009]本專利技術中，檢測處理組斑馬魚胚胎發育情況，可以有效評價化妝品基礎原料是否對胚胎發育的健康程度有影響；檢測處理組斑馬魚幼魚發育的畸形程度，可以評價化妝品基礎原料是否影響斑馬魚幼魚的正常生長發育；檢測處理組斑馬魚生長發育相關基因的變異程度，可以更加準確、科學評價待測化妝品基礎原料在基因層面對發育的影響。另外，由于當ROS的量超過了抗氧化系統的防御能力，氧化應激會導致魚類組織細胞多種類型的損傷，因此通過檢測ROS，可以反應機體的氧化應激程度，從而評價一類化合物對機體是否存在氧化損傷。
[0010]優選的，所述斑馬魚胚胎為野生斑馬魚AB品系胚胎。
[0011]優選的，所述基礎原料包括苯氧乙醇、對羥基苯甲酯、苯甲醇、薄荷精油和人參精油。
[0012]優選的，步驟(1)中，含有不同梯度濃度基礎原料的胚胎培養液至少有三組，且每組胚胎培養液中的放置至少5顆胚胎；步驟(2)中，對照組和每組處理組中的胚胎數目相同，且均不少于5顆。
[0013]優選的，所述孵化率根據公式孵化率＝(孵化數/胚胎總數)進行統計，其中死亡胚胎技術在未孵化的胚胎內；
[0014]測定所述心率時，每24h統計處理組和對照組中斑馬魚60s內的心跳次數，并根據心率比值＝(處理組的心跳次數/對照組的心跳次數)對心率進行測定；并測定誤差和顯著性；
[0015]所述發育畸形程度測定的評價指標包括心包水腫、脊柱畸形和卵黃囊腫。
[0016]優選的，步驟(2)中，對斑馬魚胚胎的ROS氧化應激檢測需將培養液中未進入細胞內的氧化應激指示劑DCFH
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DA充分去除，然后再勻漿使用酶標儀檢測。
[0017]優選的，步驟(2)中，ROS氧化應激檢測的步驟如下：將對照組和處理分別在培養液中培養72h后，加入DCFH
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DA，繼續孵育1
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2h后，用培養液洗滌細胞1～2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH
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DA收集胚胎進行勻漿處理，并將勻漿液置于冷凍離心機中進行離心，取上清液并使用酶標儀檢測熒光強度。
[0018]優選的，所述生長發育相關基因包括斑馬魚顱面發育相關基因hoxa1a、紅系造血發育相關基因scl、c
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myb、pu.1。
[0019]本專利技術具有以下技術效果：
[0020](1)本專利技術中采用斑馬魚模型，實驗操作簡單、快捷便利，利于大批量的原料檢測及篩選工作，且準確性較高。
[0021](2)選用剛受精發育的斑馬魚胚胎，設置多組重復，用于檢測發育毒性，更加具有代表性。
[0022](3)斑馬魚的基因與人類同源性較高，通過qPCR的方法檢測，用于對比嬰幼兒的發育毒性，更加具有可靠性。
附圖說明
[0023]圖1為基礎原料暴露72h對斑馬魚胚胎孵化率示意圖。
[0024]圖2為基礎原料暴露72h后斑馬魚心率數據對比圖。
[0025]圖3為基礎原料暴露72h后斑馬魚機體器官形態示意圖。
[0026]圖4為基礎原料暴露72h后斑馬魚機體中ROS檢測熒光強度示意圖。
[0027]圖5為基礎原料暴露72h對斑馬魚顱面發育相關基因hoxa1a轉錄水平示意圖。
[0028]圖6為基礎原料暴露72h對斑馬魚造血系統發育相關基因scl轉錄水平示意圖。
[0029]圖7為基礎原料暴露72h對斑馬魚造血系統發育相關基因c
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myb轉錄水平示意圖。
[0030]圖8為基礎原料暴露72h對斑馬魚造血系統發育相關基因pu.1轉錄水平示意圖。
具體實施方式
[0031]下面結合本專利技術的附圖和實施例對本專利技術的實施作詳細說明，以下實施例是在本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)確定待測基礎原料的安全濃度：等量選取自受精起發育至24
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72h的斑馬魚胚胎暴露于多組含有不同梯度濃度基礎原料的胚胎培養液中，培養72h，統計每組胚胎的孵化率和畸形率，選取孵化率＞95％且不會引起斑馬魚機體器官損傷、發育畸形的基礎原料濃度作為安全濃度；(2)評價發育毒性：將自受精起發育至24
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72h的斑馬魚胚胎平均分為對照組及多組處理組，其中，對照組的斑馬魚胚胎不予給藥正常培養，處理組的斑馬魚暴露于具有安全濃度基礎原料的胚胎培養液培養，培養72h后，對其進行心率、發育畸形程度、ROS氧化應激以及生長發育相關基因表達情況的測定評價，根據測定結果評價所述基礎原料的發育毒性。2.根據權利要求1所述的一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，其特征在于，所述斑馬魚胚胎為野生斑馬魚AB品系胚胎。3.根據權利要求1所述的一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，其特征在于，所述基礎原料包括苯氧乙醇、對羥基苯甲酯、苯甲醇、薄荷精油和人參精油。4.根據權利要求1所述的一種利用斑馬魚評價化妝品基礎原料對嬰幼兒發育毒性的方法，其特征在于，步驟(1)中，含有不同梯度濃度基礎原料的胚胎培養液至少有三組，且每組胚胎培養液中的放置至少5顆胚胎；步驟(2)中，對照組和每組處理組中的胚胎數目相同，且均不少于5顆。5.根據權利要求1所述的一種利用斑馬魚評價化妝...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張陽，張璇，付寅，王紫藩，蔣旭峰，王衛國，李亮，韓新彬，
申請(專利權)人：青蛙王子福建嬰童護理用品有限公司，
類型：發明
國別省市：