一種熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)利用缺失突變技術(shù)構(gòu)建Fosl1蛋白突變體，篩選到突變體Fosl1

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
microRNA biogenesis during early development in Xenopus laevis.Genes Dev.2011,25(11):1121
?
31)。因此，需要研發(fā)一種能夠快速、有效建立Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型的技術(shù)與方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0005]本專利技術(shù)的第一個(gè)目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體。
[0006]本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供上述熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體的應(yīng)用，即所述突變體在構(gòu)建Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用，特別是在構(gòu)建心肌特異性缺失Fosl1蛋白功能的熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用。
[0007]專利技術(shù)人通過對(duì)熱帶爪蛙Fosl1蛋白的主要功能結(jié)構(gòu)域逐一進(jìn)行缺失突變，構(gòu)建了3個(gè)突變體：Fosl1
?
NT、Fosl1ΔDB及Fosl1ΔLZ。并利用報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)逐一分析了上述3個(gè)突變體對(duì)Fos家族蛋白功能的影響，最終發(fā)現(xiàn)突變體Fosl1
?
NT不但能有效抑制Fosl1蛋白的功能，而且對(duì)Fos家族其他蛋白(Fos、FosB及Fosl2)的功能并無顯著影響。因此，F(xiàn)osl1
?
NT可作為熱帶爪蛙Fosl1蛋白的特異性dominant
?
negative突變體(dnFosl1)。與以往報(bào)道的利用dnAP
?
1突變體(A
?
Fos)可抑制所有bZIP家族蛋白的功能不同，本專利技術(shù)所述dnFosl1突變體利用Fosl1蛋白的N端多肽，能特異性的抑制Fosl1蛋白的功能，而不影響Fos家族其他蛋白的功能。利用本專利技術(shù)所述的dnFosl1突變體，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速建立Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型，具有周期短，效率高等優(yōu)勢(shì)，甚至在F0代就有望能篩選到靶蛋白功能缺失型爪蛙品系。所建立的Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型，不但可用于研究Fosl1蛋白相關(guān)的疾病機(jī)制，而且能為篩選Fosl1蛋白相關(guān)疾病的藥物及靶向干預(yù)療法提供了重要的模型工具，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0008]本專利技術(shù)的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009]一種熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體，其氨基酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO.1所示)：
[0010]MYRDFTGAFPQPDSGCSSHGLRNSGSSPILGTSGMGHSVRLNPPPEDAQQKYPVHTSSGQFIPTLNAITSSQDLNWMIQPSVRPLNLPPYQSPRHGVIRNMGGVLSMGRRRNGEHLSPEEEER。
[0011]所述的Fosl1蛋白突變體的編碼序列如下所示(亦如SEQ ID NO.2所示)：
[0012]ATGTACAGAGACTTCACTGGAGCCTTCCCTCAGCCAGATTCGGGGTGCAGCAGCCACGGCCTACGGAACTCGGGATCTTCCCCAATTTTAGGAACTTCAGGAATGGGACACAGCGTCAGACTGAACCCACCACCCGAGGACGCGCAGCAGAAGTATCCAGTTCACACATCCTCGGGTCAATTTATCCCAACATTGAATGCTATCACATCAAGTCAGGACCTTAACTGGATGATCCAACCAAGTGTACGCCCCCTGAATTTACCACCATACCAAAGCCCTCGGCATGGGGTAATCCGTAACATGGGAGGAGTCTTGAGTATGGGGCGAAGGAGAAATGGAGAACATCTGTCACCAGAGGAAGAGGAGCGATAG。
[0013]上述熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體、其編碼序列、含有其編碼序列的重組表達(dá)載體或工程菌在制備Fosl1蛋白抑制劑中的應(yīng)用。
[0014]進(jìn)一步的，在所述的應(yīng)用中，F(xiàn)osl1蛋白突變體特異性抑制Fosl1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。
[0015]上述熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體、其編碼序列、含有其編碼序列的重組表達(dá)載體或工程菌在構(gòu)建Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用。
[0016]進(jìn)一步的，所述的應(yīng)用的具體操作為：將所述的Fosl1蛋白突變體隆到表達(dá)載體
中，構(gòu)建含有Fosl1蛋白突變體的轉(zhuǎn)基因載體，并注射熱帶爪蛙受精卵的動(dòng)物極，孵育，篩選成功表達(dá)Fosl1蛋白突變體的胚胎，培養(yǎng)至成蛙，獲得Fosl1蛋白失活的熱帶爪蛙品系。
[0017]所述的應(yīng)用優(yōu)選為在構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性失活Fosl1蛋白的熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用。
[0018]進(jìn)一步的，所述的應(yīng)用的具體操作為：
[0019]S1、根據(jù)編碼所述的Fosl1蛋白突變體的DNA序列，合成dnFosl1
?
T2A
?
EGFP融合DNA片段，并將合成的融合DNA片段克隆到pMlc2
?
NTR
?
T2A
?
Dendra2
opt
載體的EcoRI與HpaI酶切位點(diǎn)之間，替換原有載體中的NTRopt
?
T2A
?
Dendra2
opt
片段，進(jìn)而構(gòu)建pMlc2
?
dnFosl1
?
T2A
?
EGFP轉(zhuǎn)基因載體；其中，所述的融合DNA片段中dnFosl1是Fosl1蛋白突變體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；T2A是連接肽，其核苷酸序列如下所示：GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA；
[0020]S2、將步驟S1所制備的pMlc2
?
dnFosl1
?
T2A
?
EGFP轉(zhuǎn)基因載體與I
?
SceI歸位內(nèi)切酶共同注射熱帶爪蛙受精卵的動(dòng)物極，孵育，篩選心臟特異性表達(dá)綠色熒光的F0胚胎，培養(yǎng)至成蛙，獲得心肌細(xì)胞特異性失活Fosl1蛋白的熱帶爪蛙品系Tg(Mlc2
?
dnFosl1
?
T2A
?
EGFP)。
[0021]所述的共同注射方式為：500ng轉(zhuǎn)基因載體和20U I
?
SceI歸位內(nèi)切酶用無菌水配置成10μL的注射液，每個(gè)受精卵注射2nL。
[0022]所述的共同注射用的熱帶爪蛙受精卵為1細(xì)胞期熱帶爪蛙受精卵。
[0023]所述的孵育為孵育胚胎至45期(St45)。
[0024]所述的篩選采用熒光體式顯微鏡實(shí)現(xiàn)。
[0025]所述的培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液為MBS胚胎培養(yǎng)液，優(yōu)選為0.1
×
MBS胚胎培養(yǎng)液，配制方法為稱取NaCl 25.9g、Hepes 11.9g、NaHCO
3 1.0g、KCl 0.4g、MgSO
4 0.5g、Ca(NO3)
2 0.8g、CaCl...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體，其特征在于：所述的Fosl1蛋白突變體的編碼序列如SEQ ID NO.2所示。3.權(quán)利要求1所述的熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體、其編碼序列、含有其編碼序列的重組表達(dá)載體或工程菌在制備Fosl1蛋白抑制劑中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：在所述的應(yīng)用中，F(xiàn)osl1蛋白突變體特異性抑制Fosl1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。5.權(quán)利要求1所述的熱帶爪蛙Fosl1蛋白突變體、其編碼序列、含有其編碼序列的重組表達(dá)載體或工程菌在構(gòu)建Fosl1蛋白功能缺失型熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的應(yīng)用的具體操作為：將所述的Fosl1蛋白突變體的編碼序列克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建含有Fosl1蛋白突變體的轉(zhuǎn)基因載體，并注射熱帶爪蛙受精卵的動(dòng)物極，孵育，篩選成功表達(dá)Fosl1蛋白突變體的胚胎，培養(yǎng)至成蛙，獲得Fosl1蛋白失活的熱帶爪蛙品系。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的應(yīng)用為在構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性失活Fosl1蛋白的熱帶爪蛙模型中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的應(yīng)用的具體操作為：S1、根據(jù)編碼所述的Fosl1蛋白突變體的DNA序列，合成dnFosl1
?
T2A
?
EGFP融合DN A片段，并將合成的融合DNA片段克隆到pMlc2
?
NTR
?
T2A
?
Dendra2
opt
載體的EcoRI與HpaI酶切位點(diǎn)之間，替換原有載體中的NTRopt
?
T2A
?
Dendra2
opt
片段，進(jìn)而構(gòu)建pMlc2
?
dnFosl1
?
T2A
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：齊緒峰，廖珠琴，周毅民，蔡冬青，鄭莉，吳海燕，馮珊珊，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：暨南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：