修飾線性核苷酸的方法、用于探針延伸的試劑技術

本發(fā)明專利技術涉及一種修飾線性核苷酸的方法、用于探針延伸的試劑。修飾新鄉(xiāng)核苷酸的方法包括：獲取作為底物的線性核苷酸acyNTP，acyNTP包括acyATP、acyCTP、acyGTP以及acyTTP；通過ddTTP替換acyNTP中的acyTTP；并與acyATP,acyGTP,acyCTP進行混合；優(yōu)化ddTTP與acyATP、acyCTP、acyGTP的濃度比例，以使四種核苷酸保持相當的延伸效率；通過將修飾的核苷酸應用到核酸質譜的基因分型檢測中，保證單堿基延伸酶對不同結構的核苷酸延伸效率相當的同時，使產物分子量之間差異大于9Da，可用于常規(guī)飛行時間質譜。間質譜。間質譜。

【技術實現步驟摘要】
修飾線性核苷酸的方法、用于探針延伸的試劑


[0001]本專利技術涉及檢測
，尤其涉及修飾線性核苷酸的方法、用于探針延伸的試劑。

技術介紹

[0002]單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中發(fā)生的頻率高于1％，是人類可遺傳的變異中最常見的一種，因此，SNP的檢測對遺傳病的診斷、篩查以及用藥等方面有及其重要的指導作用。
[0003]目前，SNP檢測的方法學主要包含實時熒光PCR法、PCR基因芯片法、PCR電泳法、PCR毛細電泳法分析法、PCR高分辨溶解曲線法、流式熒光雜交法、飛行時間質譜法，焦磷酸測序法、Sanger測序法等。其中，實時熒光PCR法、PCR電泳法、PCR毛細電泳法分析法、PCR高分辨溶解曲線法和流式熒光雜交法的優(yōu)點在于耗時較短、靈敏度較高，能夠實現某些場景下的檢測，但因其通量有限，所以無法方便快捷地滿足臨床對于數十個甚至數百個基因位點的檢測需求。基因芯片法、焦磷酸測序法和Sanger測序法，雖然檢測較為準確，但檢測成本較高，耗時較長，并不是SNP檢測的首要選擇。而飛行時間質譜法，檢測速度快，數據分析簡單，通量較高，即彌補了傳統(tǒng)方法學的不足，又降低了成本，相比前面幾種方法是一種更好的選擇，但卻存在檢測結果不夠準確的問題，使其應用的進一步發(fā)展受到了限制。
[0004]核酸質譜SNP檢測主要基于PCR和引物延伸技術，其原理是首先通過PCR引物對待檢測SNP位點的目標片段進行擴增，產生的PCR產物經過蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)處理殘留的dNTPs，使其無法作為延伸的原料。SAP消化反應結束后，向反應液中加入緩沖液，延伸引物，雙脫氧核糖核苷酸以及單堿基延伸酶等組分進行單堿基延伸反應。以DNA擴增產物為模板，延伸探針與待檢測SNP位點的5
’
端緊密結合，延伸一個堿基后由于雙脫氧核糖核苷酸作用使延伸反應終止。引物延伸完成后，向反應液中加入離子交換樹脂進行脫鹽純化處理，去除吸附在核酸片段上的副產物金屬離子。脫鹽完成后，將樣品與基質轉移到靶板形成共結晶，通過質譜檢測獲得譜圖。通過計算譜圖中產物的分子量與延伸引物的分子量的差值可分析該樣品SNP位點的分型。
[0005]然而，以ddNTP作為底物時，單堿基延伸酶的結合效率低，延伸效果差，影響譜圖結果判斷的準確性。另外一種可用于單堿基延伸的核苷酸底物為線性核苷酸(acyclonucleotides，acyNTP)，線性核苷酸為一種核苷酸類似物，其結構中沒有常規(guī)核苷酸中的5元環(huán)結構，而是將3，4號位的
“?
CH2
?”
結構去除，整個分子結構呈現線性。acyNTP尤其適用于古生菌DNA聚合酶的反應，特別是Therminator DNA聚合酶。Therminator DNA聚合酶經過基因工程改造后，擁有更強的摻入核苷酸類似物的能力，特別是acy堿基類似物，對于acyNTP的識別效率為普通ddNTP的30倍。
[0006]現有技術中acyNTP作為底物主要應用于測序，在核酸質譜SNP檢測中應用較少。acyNTP作為底物時，acyCTP、acyATP、acyGTP和acyTTP分子量分別為425.12、449.12、465.14、440.1。
[0007]明顯的acyATP與acyTTP核苷酸之間分子量的差異為9Da，然而飛行時間質譜儀很難有效區(qū)分9Da差異的特征峰，尤7000Da 12000Da的大分子質量檢測區(qū)間內，也因此導致質譜儀無法對SNP進行精準分型。
[0008]本申請旨在建立一種修飾線性核苷酸的方法以使得各個核苷酸之間分子量可以區(qū)分，提高譜圖分辨率與結果判讀準確率。

技術實現思路

[0009]為了實現根據本專利技術的上述目的和其他優(yōu)點，涉及種用于核酸質譜的修飾的核苷酸類似物組合，利用該組合可進行核酸質譜方法基因分型。本專利技術的第一個目的是提供一種修飾線性核苷酸組合物的方法，包括以下步驟：
[0010]獲取作為底物的線性核苷酸acyNTP，所述acyNTP包括acyATP、acyCTP、acyGTP以及acyTTP；
[0011]通過ddTTP替換acyNTP中的acyTTP；并與acyATP,acyGTP,acyCTP進行混合；
[0012]優(yōu)化所述ddTTP與acyATP、acyCTP、acyGTP的濃度比例，以使四種核苷酸保持相當的延伸效率。
[0013]優(yōu)選地，所述ddTTP為Dig
?
11
?
ddUTP，結構式為：
[0014][0015]優(yōu)選地，所述ddTTP為3'
?
Azido
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ddUTP，結構式為：
[0016][0017]優(yōu)選地，所述ddTTP為3'
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MeTriazol
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ddUTP，結構式為：
[0018][0019]優(yōu)選地，所述ddTTP為5
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Ethyl
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ddUTP，結構式為：
[0020][0021]優(yōu)選地，所述ddTTP為3',5
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diF
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ddTTP，結構式為：
[0022][0023]本專利技術的第二個目的是提供一種用于探針延伸的試劑，所述試劑包含上述通過ddTTP取代acyNTP中的acyTTP后的修飾線性核苷酸。
[0024]優(yōu)選地，所述修飾線性核苷酸與無環(huán)核苷酸的濃度比為1
?
10:1。
[0025]優(yōu)選地，所述修飾線性核苷酸與無環(huán)核苷酸的濃度比為8:1。
[0026]相比現有技術，本專利技術的有益效果在于：
[0027]本專利技術提供了一種本專利技術涉及一種修飾線性核苷酸的方法、用于探針延伸的試劑。修飾新鄉(xiāng)核苷酸的方法包括：獲取作為底物的線性核苷酸acyNTP，acyNTP包括acyATP、acyCTP、acyGTP以及acyTTP；通過ddTTP替換acyNTP中的acyTTP；并與acyATP,acyGTP,acyCTP進行混合；優(yōu)化ddTTP與acyATP、acyCTP、acyGTP的濃度比例，以使四種核苷酸保持相當的延伸效率；通過將修飾的核苷酸應用到核酸質譜的基因分型檢測中，保證單堿基延伸酶對不同結構的核苷酸延伸效率相當的同時，使產物分子量之間差異大于9Da，可用于常規(guī)飛行時間質譜。本專利技術通過單分子核苷酸的簡單修飾，僅需一種核苷酸修飾，其余三種核苷酸為現有產品，并且延伸率經過濃度比優(yōu)化后與天然的核苷酸延伸效率相當。
[0028]上述說明僅是本專利技術技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本專利技術的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本專利技術的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。本專利技術的具體實施方式由以下實施例及其附圖詳細給出。
附圖說明
[0029]此處所說明的附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，構成本申請的一部分，本專利技術的示意性實本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種修飾線性核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：獲取作為底物的線性核苷酸acyNTP，所述acyNTP包括acyATP、acyCTP、acyGTP以及acyTTP；通過ddTTP替換acyNTP中的acyTTP；并與acyATP,acyGTP,acyCTP進行混合；優(yōu)化所述ddTTP與acyATP、acyCTP、acyGTP的濃度比例，以使四種核苷酸保持相當的延伸效率。2.如權利要求1所述的修飾線性核苷酸的方法，其特征在于，所述ddTTP為Dig
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ddUTP，結構式為：3.如權利要求1所述的修飾線性核苷酸的方法，其特征在于，所述ddTTP為3'
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Azido
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ddUTP，結構式為：4.如權利要求1所述的修飾線性核苷酸的方法，其特征在于，所述ddTTP為3'
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【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：朱思宇，王彤，白鵬利，胡瑋，李艷，徐振，程文播，
申請(專利權)人：蘇州國科醫(yī)工科技發(fā)展集團有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：