【技術實現步驟摘要】
金屬離子摻雜硼納米片復合物用作外泌體比率電化學適體傳感器的制備方法
[0001]本專利技術屬于金屬離子摻雜硼納米片復合物和外泌體比率電化學適體傳感器的制備
，具體涉及金屬離子摻雜硼納米片復合物用作外泌體比率電化學適體傳感器的制備方法，該制備的比率電化學適體傳感器可用于生物流體樣品中外泌體的高靈敏性和高選擇性定量檢測。
技術介紹
[0002]硼烯是后石墨烯時代科學家致力尋找的性能優良的極具代表性單元素二維納米材料之一，硼烯是由單一硼元素構成的二維平面結構，具有獨特的二維六角蜂窩狀結構。理論計算結果表明，硼烯處于缺電子狀態，在自由狀態下其六角蜂窩狀結構的存在形式是不穩定的，因此硼烯不是自然存在的，需通過人工合成獲得。研究者早期采用了自下而上途徑去合成硼烯，包括分子束外延生長法、化學氣相沉積生長法、高真空原子濺射法等，但普遍存在成本高昂、條件苛刻、操作復雜、產量有限、產物轉移困難等問題，阻礙了這些合成途徑的推廣應用。相比之下，采用自上而下的途徑可有效合成出硼烯衍生物，例如在超聲輔助下液相剝離硼粉末可獲得獨立式結構的薄層硼納米片。密度泛函理論計算研究表明，在液相剝離過程中硼納米片因暴露在氧環境中，硼容易與氧發生反應生成硼氧化物，進而使硼納米片氧化和降解，結構穩定性和理化性能受到削弱。
[0003]硼原子核外僅三個電子，呈現電子缺失狀態，硼sp2價電子易雜化，配位數大，共價半徑短，易與其它元素形成強化學鍵。堿金屬如鉀，堿土金屬如鎂，過渡金屬如鐵、鈷、鎳、銅和銀等的空軌道可與硼的孤對電子形成金屬
?>硼配位，補償硼原子和硼納米片的電子缺陷，使硼的孤對電子被占據，不再與氧發生反應而使硼納米片的結構遭到破壞。金屬進入硼納米片的層間結構促進了片層剝離，能防止金屬原子聚集，也增強了硼納米片電化學活性。因此，在金屬離子存在下，采用自上而下的超聲輔助液相剝離硼粉末的方法可制得結構穩定和性能優越的硼納米片。
[0004]外泌體是一種新型的腫瘤生物標志物，能特異性識別特定腫瘤細胞的跨膜蛋白，用于特定腫瘤的早期精準篩查，是經歷內溶體途徑從多囊體中釋放得到，為50～100納米的細胞外囊泡，攜帶來自親本的大量生物大分子，如跨膜蛋白、胞質蛋白、DNA、mRNA等。外泌體作為介導細胞間信息的信使，能反映腫瘤相關生理狀態及其改變，而對腫瘤進行早期預判和診斷。外泌體檢測方法主要包括流式細胞術、表面等離子共振、納米顆粒追蹤、比色、發光、電分析等。Zhang等報導了Ti3C
2 MXenes納米片催化的電致化學發光生物傳感器檢測外泌體(Huixin Zhang,Zonghua Wang,Qiuxia Zhang,Feng Wang,Yang Liu.Ti3C2MXenes nanosheets catalyzed highly efficient electrogenerated chemiluminescence biosensor for the detection of exosomes.Biosensors and Bioelectronics,2019,124
–
125,184
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190)；Dold
á
n等報導基于表面標志物介導信號放大的電化學三明治免疫傳感器用于外泌體的檢測(Ximena Dold
á
n,Pablo Fag
ú
ndez,Alfonso Cayota,Justo La
í
z,
Juan Pablo Tosar,Electrochemical sandwich immunosensor for determination of exosomes based on surface marker
?
mediated signal amplification,Analytical Chemistry,2016,88,10466
?
10473)。金芳芳等公開了一種流式細胞儀檢測外泌體的方法(金芳芳；王延博；徐學博；陳張朋；薛姜飛.一種流式細胞儀檢測外泌體的方法.國家專利技術專利.公開號CN110702589A)。截止目前，尚未有關于金屬離子摻雜硼納米片復合物作為比率電化學適體傳感器用于外泌體的高靈敏性和高選擇性定量檢測的國內外文獻和專利報道。
技術實現思路
[0005]本專利技術之目的在于發展一種新穎和高效的基于金屬離子摻雜硼納米片復合物用作外泌體比率電化學適體傳感器的制備方法，該制備的比率電化學適體傳感器可用于生物流體樣品中外泌體的高靈敏性和高選擇性定量檢測。
[0006]為實現上述目的，本專利技術涉及的金屬離子摻雜硼納米片復合物用作外泌體比率電化學適體傳感器，其制備方法具體包括以下步驟：
[0007](1)在攪拌下，向150～200毫升N
?
甲基吡咯烷酮中加入120～150毫克硼粉末，以形成硼粉末分散液，然后在攪拌下逐滴加入金屬鹽，如氯化鉀、氯化鎂、氯化鐵、氯化銅、硝酸鈷、硝酸鎳、硝酸銀等的水溶液以形成混合液，調節硼濃度為0.6～1.0毫克/毫升，調節金屬鹽濃度為0.06～0.1毫克/毫升；
[0008](2)采用探針超聲在600～800瓦功率下處理上述混合液，首先超聲5秒然后暫停10秒，重復超聲
?
暫停的循環操作，整個過程維持在20～60分鐘；
[0009](3)量取5毫升二次蒸餾水，在攪拌下加入5～10毫克谷胱甘肽GSH以形成水溶液，將其逐滴加入到探針超聲處理后的混合液中，然后采用浴池超聲在1000～1100瓦功率下連續處理該混合液6～12小時，制得GSH修飾的金屬離子摻雜薄層硼納米片M
?
BNS分散液，其質量濃度調節為0.1～0.5毫克/毫升；
[0010](4)取一根表面潔凈的玻碳電極GCE，將0.5％萘酚的乙醇溶液5微升滴加在GCE表面，干燥后將制得的M
?
BNS分散液3～5滴滴涂在萘酚修飾的GCE表面，干燥后再滴加0.1％硫堇TH的乙醇溶液2～3滴，在上述逐滴添加過程中，每滴1滴后等GCE表面干燥后再滴下一滴，干燥后形成TH/M
?
BNS/GCE修飾電極；
[0011](5)將1～10微摩爾/升的一端二茂鐵Fc標記的單鏈DNA適體溶液在37℃下孵育30～120分鐘，吸取3～5滴適體溶液滴涂在TH/M
?
BNS修飾的GCE表面，干燥后制得Fc
?
DNA/TH/M
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BNS/GCE復合物修飾電極，干燥后在此復合物修飾電極的表面滴加含不同外泌體Exo濃度的液體樣品，制得待測電極；
[0012](6)將待測電極插入含10毫摩爾/升磷酸鹽水緩沖液的電解池中，采用電化學工作站三電極系統測量電化學方波伏安曲線，以硫堇TH為參比，二茂鐵Fc為響應，以特征電位處Fc(0.15V)與TH(
?
0.22V)電流峰強度比值I
Fc
/I
TH
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【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.金屬離子摻雜硼納米片復合物用作外泌體比率電化學適體傳感器的制備方法，其特征在于，該制備方法具體包括以下步驟：(1)在攪拌下，向150～200毫升N
?
甲基吡咯烷酮中加入120～150毫克硼粉末，以形成硼粉末分散液，然后在攪拌下逐滴加入金屬鹽，如氯化鉀、氯化鎂、氯化鐵、氯化銅、硝酸鈷、硝酸鎳、硝酸銀等的水溶液以形成混合液，調節硼濃度為0.6～1.0毫克/毫升，調節金屬鹽濃度為0.06～0.1毫克/毫升；(2)采用探針超聲在600～800瓦功率下處理上述混合液，首先超聲5秒然后暫停10秒，重復超聲
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暫停的循環操作，整個過程維持在20～60分鐘；(3)量取5毫升二次蒸餾水，在攪拌下加入5～10毫克谷胱甘肽GSH以形成水溶液，將其逐滴加入到探針超聲處理后的混合液中，然后采用浴池超聲在1000～1100瓦功率下連續處理該混合液6～12小時，制得GSH修飾的金屬離子摻雜薄層硼納米片M
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BNS分散液，其質量濃度調節為0.1～0.5毫克/毫升；(4)取一根表面潔凈的玻碳電極GCE，將0.5％萘酚的乙醇溶液5微升滴加在GCE表面，干燥后將制得的M
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BNS分散液3～5滴滴涂在萘酚修飾的GCE表面，干燥后再滴加0.1％硫堇TH的乙醇溶液2～3滴，在上述逐滴添加過程中，每滴1滴后等GCE表面干燥后再滴下一滴，干燥后形成TH/M
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