純化和/或病毒滅活的方法技術

本發明專利技術涉及蛋白質(例如糖蛋白)的純化和/或病毒滅活的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質(例如糖蛋白)的步驟。的組合處理所述蛋白質(例如糖蛋白)的步驟。的組合處理所述蛋白質(例如糖蛋白)的步驟。

【技術實現步驟摘要】
純化和/或病毒滅活的方法
[0001]本專利技術涉及蛋白質(或蛋白質產品)的純化方法和/或蛋白質(或蛋白質產品)的病毒滅活方法。本專利技術涉及糖蛋白(或糖蛋白產品)的純化方法和/或糖蛋白(或糖蛋白產品)的病毒滅活方法。蛋白質/糖蛋白可以是例如在宿主細胞中產生的重組糖蛋白，諸如FSH、hCG或LH。蛋白質/糖蛋白可以是來源于尿的。
[0002]許多糖蛋白用于治療性治療。例如，促性腺激素是一類用于治療不育的糖蛋白。促性腺激素是一組異源二聚糖蛋白激素，其調節雄性和雌性中的性腺功能。它們包括促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)。
[0003]從懷孕的和更年期后的女性的尿中提取的FSH和hCG已經在不育治療中使用了許多年。從尿中提取的FSH和hCG的產生涉及大量尿的收集和處理。
[0004]作為來源于尿的產品的備選方案，重組形式的FSH和hCG是可用的。目前批準的產品(來自Merck Serono的Gonal
?
F,Ovitrelle；來自MSD的Puregon)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生(表達)。
[0005]本申請人已經開發了重組FSH和重組hCG，兩者均在細胞系中表達。來源于細胞系的FSH產品及其生產方法在國際專利申請號PCT/GB2009/000978(公開為WO2009/127826A)和PCT/EP2012/065507(公開為WO2013/020996)中公開。該產品(FE999049)已經在歐洲完成了III期臨床試驗。來源于細胞系的重組hCG產品及其生產方法在PCT/GB2010/001854(公開為WO2011/042688)中公開。
[0006]本申請人已經開發了可以用于純化例如在哺乳動物細胞系中產生的重組FSH和重組hCG的技術(例如，WO2009/127826A和WO2013/020996中公開的重組FSH，和WO2011/042688中公開的重組hCG)。
[0007]根據本專利技術，在第一個方面，提供了一種純化蛋白質[例如，糖蛋白，例如重組糖蛋白，(例如重組的)促性腺激素，(例如重組的)FSH、hCG或LH]的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質[例如，糖蛋白，例如重組糖蛋白，(例如重組的)促性腺激素，(例如重組的)FSH、hCG或LH]的步驟。
[0008]所述方法可以包括用辛酸和乙醇的組合處理蛋白質的溶液[例如，在水、緩沖液或其它介質(例如，緩沖液；100 mM乙酸銨，30
?
50 mM NaCl，pH 9
?
pH 9.5)中]。所述方法可以包括在pH 6.5至12，例如pH 7.5至10，例如pH 9至9.5處理在緩沖液(例如乙酸銨緩沖液)中的蛋白質(例如糖蛋白)的溶液。
[0009]用辛酸和乙醇的組合處理糖蛋白的步驟可以在酸性pH進行，例如在pH 2至pH 6.5，例如pH 3至pH 6.5，例如pH 4至pH 6(例如pH 5.5
±
0.1)，優選pH 4.5至pH 5.5]進行。使用酸性條件(例如，pH 4
–
pH 6)歸因于辛酸活性。辛酸能夠通過破壞病毒膜來滅活包膜病毒；這通過辛酸的不帶電形式(其能夠穿透病毒疏水膜)實現。辛酸在接近其pKa的pH(pH 4.9)是不帶電的。在1單位升高的ΔpH(～pH 5.9)下，100％的辛酸分子帶負電荷，并且因此對病毒滅活效率較低。
[0010]蛋白質可以是重組蛋白質或來源于尿的蛋白質。蛋白質可以是糖蛋白。蛋白質/糖蛋白可以是促性腺激素，例如FSH、hCG或LH。糖蛋白可以是重組糖蛋白，例如重組促性腺激
素，例如重組FSH、hCG或LH。優選地，蛋白質/糖蛋白是通過以下方法在細胞(細胞系)中產生的重組糖蛋白(例如重組促性腺激素，例如重組FSH、hCG或LH)，所述方法包括在合適的培養基中培養細胞(細胞系)并且從所述細胞(細胞系)和/或所述培養基收獲重組糖蛋白(例如，從細胞培養上清中收獲重組蛋白質)。所述細胞(細胞系)可以是哺乳動物細胞(細胞系)，例如CHO細胞(系)，細胞(系)，HEK293細胞(系)，HT1080細胞(系)，COS細胞(系)，NOS細胞(系)，SP20細胞(系)等。優選地，細胞(細胞系)是細胞(系)。
[0011]糖蛋白(促性腺激素，FSH，hCG，LH等)，無論它們是尿的或重組的，通常都是培養基中的溶液/懸浮液的形式。如本領域所熟知的，糖蛋白可以作為單一同種型或作為同種型的混合物存在。在本文中，術語蛋白質、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等涵蓋包含蛋白質、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等的溶液或懸浮液。在本文中，術語蛋白質、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等涵蓋包含蛋白質、糖蛋白、FSH、hCG、LH等的溶液或懸浮液，其中所述蛋白質、糖蛋白、FSH、hCG、LH等作為單一同種型或作為同種型的混合物存在。因此，術語FSH涵蓋包含FSH的溶液或懸浮液(例如，其中FSH作為單一同種型或作為同種型的混合物存在)。
[0012]在本文中，短語“用辛酸和乙醇的組合處理蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)”意指將辛酸和乙醇二者應用于蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)，使得蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)同時暴露于辛酸和乙醇二者。因此，該短語涵蓋了這樣的技術，其中辛酸和乙醇作為混合物或作為兩個分離的試劑被添加至蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的溶液中，因此溶液變成辛酸、乙醇和蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的混合物；該短語也涵蓋了辛酸和乙醇二者同時作用于蛋白質(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的其它技術。
[0013]申請人已經意想不到地發現，在酸性pH，用乙醇和辛酸(例如20mM辛酸/30％乙醇的組合)處理含有重組蛋白質/糖蛋白(例如重組FSH，重組hCG)的溶液可以導致一些病毒的變性(導致其滅活)和/或其它病毒和宿主細胞蛋白質(雜質)的沉淀。然后可以將溶液離心或過濾(以去除沉淀的病毒和/或宿主細胞蛋白質，例如使用深度過濾器諸如玻璃過濾器)，使得上清包含純化的糖蛋白(例如重組FSH，重組hCG)以用于后續的處理和使用。申請人已經發現用乙醇和辛酸處理含有重組糖蛋白(例如重組FSH，重組hCG)的溶液可以(i)滅活包膜病毒；和/或(ii)通過沉淀清除無包膜病毒(沉淀的病毒然后可以通過后續的離心或過濾(通過例如玻璃纖維過濾器)的步驟去除)；和/或(iii)通過沉淀去除宿主相關的蛋白質(沉淀的宿主相關的蛋白質然后能夠通過后續的離心或過濾(通過例如玻璃纖維過濾器)的步驟去除)。這種相對簡單的處理和過濾方法提供了顯著的雜質去除(在該方法中去除了64％至79％的宿主相關的雜質)，而產物糖蛋白損失最小(即產量高)。
[0014]使用辛酸和乙醇(例如在重組FSH和/或重組hCG的純化/病毒滅活中)具有其它優點。首先，辛酸與乙醇的組合可以縮短純化過程，因為本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種純化蛋白質的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質的步驟。2.一種蛋白質中病毒滅活的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質的步驟。3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其包括用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質的溶液(例如在緩沖液中)。4.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述蛋白質是糖蛋白。5.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述蛋白質是FSH、hCG或LH。6.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述蛋白質是重組糖蛋白。7.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述蛋白質(例如糖蛋白)是通過以下方法在細胞中產生的重組蛋白質(例如重組糖蛋白)，所述方法包括在合適的培養基中培養所述細胞并且從所述細胞和/或所述培養基收獲所述重組蛋白(例如重組糖蛋白)。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。9.根據任一前述權利要求所述的方法，其中用辛酸和乙醇的組合處理所述蛋白質在pH 2至pH 6.5，例如pH 3至pH 6.5，例如pH 4至pH 6，例如pH 4.5至pH 5.5進行。10.根據任一前述權利要求所述的方法，其中辛酸濃度是10mM至30mM辛酸和/或所述乙醇是20％至50％EtOH。11.根據任一前述權利要求所述的方法，其包括：(a)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：詹尼，
申請(專利權)人：輝凌公司，
類型：發明
國別省市：